COMPOSICIÓN MARCADORA DE BIOFILMS Y MÉTODO DE DETECCIÓN DE LOS MISMOS EN SUPERFICIES.

Composición marcadora de biofilms y método de detección de los mismos en superficies.

La presente invención se refiere a una composición marcadora de biofilms caracterizada porque comprende: al menos un agente de tinción, que preferiblemente es Rodamina, en un porcentaje en peso respecto al peso total de la composición comprendido entre 0,1% y 1% incluidos ambos límites; al menos un tensioactivo no iónico; al menos un tensioactivo aniónico; al menos un agente quelante, y agua mezclados en diferentes concentraciones. Asimismo, la presente invención engloba un spray o aerosol marcador de biofilms en superficies que contiene la composición referida, en cualquiera de sus variantes, y un procedimiento para identificar visualmente dichos biofilms en superficies que comprende contactar la composición marcadora de biofilms objeto de la invención con una superficie a analizar, y aclarar la superficie con un solvente polar. El tinte queda adherido al biofilm, pudiendo identificar visualmente su presencia en la superficie.

Composición marcadora de biofimls y método de detección de los mismos en superficies

CAMPO TÉCNICO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se enmarca en el campo de la identificación de biofilms, también denominados como biopelículas, películas biológicas, biocapas o películas microbianas, formados por microorganismos, técnica vinculada al análisis químico y bioquímico de sustancias y de importante aplicación en múltiples áreas: medio ambiente, agroalimentación y cualquier otro área en el que se produce crecimiento de microorganismos en los dispositivos y maquinaria utilizados.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

...Los productos de la familia FilmTracer (Invitrogen, Ltd (Reino Unido) ) son tintes específicos de células en biofilms que permiten la monitorización del crecimiento de biofilms en superficies mediante microscopía de fluorescencia, tras un periodo de contacto de 30 minutos. Este método requiere el uso de un microscopio de fluorescencia para observar los resultados, y no permite el análisis in situ de las superficies, ya que es necesario transportar la muestra hasta el microscopio.

...Por otra parte, Mathur et al. (Indian Journal of Medical Microbiology, 2006, 24 (1) :25-29) describen un método para la detección de la formación de biofilms de staphilococos basado en la coloración con rojo congo. Sin embargo, este método requiere el muestreo de la superficie y posterior incubación en medio de cultivo con el colorante, y ha demostrado producir falsos negativos.

...El uso de colorantes para la detección de la placa dental (una forma de biofilm) es ya conocido, especialmente mediante el uso de eritrosina o fluoresceína (Gillings B., Harvey B., Journal of Dental Research, 1975, 54 (3) ) . Sin embargo, estos métodos son poco específicos y requieren el uso de lámparas especiales para la identificación.

Las técnicas más conocidas en el campo de la identificación y limpieza de biofilms en superficies requieren la toma de muestras de dicha superficie y su posterior análisis en laboratorio microbiológico. Se han desarrollado por ejemplo procesos enzimáticos, en los que el biofilm se detecta, desprende y elimina mediante su exposición a un preparado que contiene enzimas (ES 2162593) u otros marcadores biológicos como proteínas (WO 2009/018369 A2) .

En el área de la identificación y caracterización de muestras biológicas, como biofilms y células, también se emplean compuestos para tinción, aunque la utilización de estos tintes siempre requiere emplear conjuntamente técnicas de microscopía.

Frente a estos métodos, la presente invención ofrece como alternativa ventajosa las composiciones de identificación visual de biofilms en superficies que se describen a continuación y su método de aplicación, que no requieren toma de muestras porque se aplican in situ sobre la propia superficie a analizar (proceso no destructivo) ni análisis de microscopía ya que permiten detectar el biofilm a simple vista. Asimismo, este método no requiere de personal especializado o equipamiento especial para su aplicación, ya que se presenta en un formato listo para su uso y fácilmente transportable.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Constituye un primer objeto de la presente invención una composición marcadora de biofilms, que comprende:

-al menos un agente de tinción, en un porcentaje en peso respecto al peso total de la composición comprendido entre 0, 1% y 1% incluidos ambos límites;

-al menos un tensioactivo no iónico,

-al menos un tensioactivo aniónico, y

-agua.

Dicha composición actúa de marcador visual de los biofilms en superficies, lo que permite su rápida y sencilla identificación. El o los agentes de tinción se adhieren de forma específica a la matriz del biofilm, y gracias a los tensioactivos y quelantes la composición es resistente al lavado con solventes polares (agua, alcohol…) , de tal forma que se tiñe el biofilm de un color característico y los agentes de tinción no son arrastrados al limpiar o aclarar la superficie a analizar con un solvente polar, quedando las zonas con biofilm marcadas con el colorante para su detección.

La principal ventaja de la presente composición es que, a diferencia de las técnicas habituales para detección de biofilms en superficies, su uso no requiere la toma de muestras de la superficie a analizar (es decir, es una técnica no ES 2 397 333 Al

destructiva) , y hace innecesario el posterior análisis microbiológico en laboratorio, porque se puede comprobar de manera visual sobre la propia superficie si se ha formado o no un biofilm.

Se pueden utilizar diversos agentes de tinción, tales como Rodamina y sus variantes – tales como Rodamina B, Rodamina 6G y Rodamina 123 -, Sudan Black B, Azul de Coomassie, Verde malaquita, Sudan red, Rojo congo, Fucsina básica, Eritrosina, Rojo rutenio y combinaciones de ellos. La Rodamina es de color fucsia intenso, tiñendo el biofilm de dicho color.

El agente de tinción preferido es la Rodamina, y más preferentemente la Rodamina B. La Rodamina es capaz de teñir biofilms de distintos microorganismos, mientras que otros tintes son más específicos o no funcionan tan bien en superficies de distintos materiales.

En una realización particular de la composición marcadora, el al menos un tensioactivo no iónico está presente en un porcentaje comprendido entre 0, 1% y 6, 0%, incluidos ambos límites, en peso respecto al peso total de la composición. Preferentemente, el al menos un tensioactivo no iónico es seleccionado dentro del grupo compuesto por una amina, un óxido de amina y un N-óxido. Otros grupos de tensioactivos no iónicos que se pueden utilizar (deben generar espuma) son: alquilpoliglucósidos y alcoholes grasos etoxilados. Más preferiblemente cuando el tensioactivo no iónico es un óxido de amina, el tensioactivo no iónico es seleccionado entre óxido de amina láurica y óxido de alquildimetilamina. Más preferentemente todavía, el óxido de amina es N-óxido de C10-C16-alquildimetil amina.

La composición puede comprender, opcionalmente, al menos un agente quelante que mejora la estabilidad de la espuma. El al menos un agente quelante puede estar presente en la composición en un porcentaje comprendido entre 0, 1% y 1, 0% en peso, incluidos ambos límites, respecto al peso total de la composición. El o los agentes quelantes pueden ser cualquier compuesto conocido como tal en el campo, tales como EDTA y NTA (ya incluidos) , derivados de ácido fosfónico como fosfonatos, y carboxilatos (por ejemplo derivados de ácido cítrico o ácido glucónico) . Como ejemplo, dicho agente es seleccionado dentro del grupo compuesto por ácido aminotrimetilenfosfónico, ácido etilendiaminotetrametilenfosfónico, ácido etilendiaminotetraacético, ácido nitrilotriacético y fosfato trisódico.

El o los tensioactivos aniónicos están presentes de manera preferida en un porcentaje comprendido entre 2, 0% y 8, 0% en peso, incluidos ambos límites, respecto al peso total de la composición. Tensioactivos aniónicos pueden ser por ejemplo, ácidos carboxílicos y sus sales, ácidos sulfónicos y sus sales, ésteres del ácido fosfórico y sus sales. Dichos tensioactivos son preferiblemente un éster del ácido sulfúrico, siendo más preferentemente seleccionados entre lauril éter sulfato de sodio, alquil éter sulfato de sodio y alquil éter sulfato de amonio.

En cuanto al agua, la composición presenta un porcentaje comprendido entre el 75, 0% y el 92, 8% incluidos ambos límites, siendo el componente mayoritario.

En una realización particular de la invención, la composición marcadora de biofilms presenta la siguiente composición:

-al menos un agente de tinción, en un porcentaje en peso respecto al peso total de la composición comprendido entre 0, 1% y 1% incluidos ambos límites;

- al menos un tensioactivo no iónico, en un porcentaje en peso respecto al peso total de la composición comprendido entre 0, 1% y 6, 0% incluidos ambos límites;

-al menos un tensioactivo aniónico, en un porcentaje en peso respecto al peso total de la composición comprendido entre 2, 0% y 8, 0% incluidos ambos límites;y

- agua, en un porcentaje en peso respecto al peso total de la composición comprendido entre 75, 0% y 92, 8% incluidos ambos límites.

En una realización particular adicional de la invención, la composición marcadora de biofilms presenta la siguiente composición:

-al menos un agente de tinción, en un porcentaje en peso respecto al peso total de la composición comprendido entre 0, 1% y 1% incluidos ambos límites;

- al menos un tensioactivo no iónico, en un porcentaje en peso respecto al...

1. Composición marcadora de biofilms, caracterizada por que comprende:

-al menos un agente de tinción, en un porcentaje en peso respecto al peso total de la composición comprendido entre 0, 1% y 1% incluidos ambos límites;

-al menos un tensioactivo no iónico,

-al menos un tensioactivo aniónico, y

-agua.

2. Composición según la reivindicación 1, donde el al menos un agente de tinción es Rodamina.

3. Composición según la reivindicación 2, donde el al menos un agente de tinción es seleccionado dentro del grupo compuesto por Rodamina B, Rodamina 6G y Rodamina 123.

4. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el porcentaje en peso respecto al peso total de la composición es el siguiente:

- el al menos un tensioactivo no iónico está presente en un porcentaje comprendido entre 0, 1% y 6, 0%, incluidos ambos límites;

-el al menos un tensioactivo aniónico está presente en un porcentaje comprendido entre 2, 0% y 8, 0%, incluidos ambos límites;

- el agua está presente en un porcentaje comprendido entre 75, 0% y 92, 8%, incluidos ambos límites.

5. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el porcentaje en peso respecto al peso total de la composición es el siguiente:

- el al menos un tensioactivo no iónico está presente en un porcentaje comprendido entre 0, 1% y 6, 0%, incluidos ambos límites;

-el al menos un tensioactivo aniónico está presente en un porcentaje comprendido entre 2, 0% y 8, 0%, incluidos ambos límites;

- el al menos un agente quelante está presente en la composición en un porcentaje comprendido entre 0, 1% y 1, 0%, incluidos ambos límites;

- el agua está presente en un porcentaje comprendido entre 75, 0% y 92, 8%, incluidos ambos límites.

6. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el al menos un tensioactivo no iónico es seleccionado dentro del grupo compuesto por una amina, un óxido de amina y un N-óxido.

7. Composición según la reivindicación 6, donde el al menos un tensioactivo no iónico es seleccionado entre óxido de amina láurica y óxido de alquildimetilamina cuando es un óxido de amina.

8. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde el al menos un tensioactivo aniónico es un éster del ácido sulfúrico.

9. Composición según la reivindicación 8, donde el al menos un tensioactivo aniónico es seleccionado dentro del grupo compuesto por lauril éter sulfato de sodio, alquil éter sulfato de sodio y alquil éter sulfato de amonio.

10. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, donde el agente quelante es seleccionado dentro del grupo compuesto por ácido aminotrimetilenfosfónico, ácido etilendiaminotetrametilenfosfónico, ácido etilendiaminotetraacético, ácido nitrilotriacético y fosfato trisódico.

11. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, donde el porcentaje en peso respecto al peso total de la composición es el siguiente: - al menos un agente de tinción, en un porcentaje comprendido entre 0, 2% y 0, 6%% incluidos ambos límites;

- al menos un tensioactivo no iónico, en un porcentaje comprendido entre 2, 0% y 3, 5% incluidos ambos límites;

- al menos un tensioactivo aniónico, en un porcentaje comprendido entre 3, 0% y 6, 0% incluidos ambos límites;

- al menos un agente quelante, en un porcentaje comprendido entre 0, 3% y 0, 5% incluidos ambos límites; y

- agua, en un porcentaje comprendido entre 82, 9% y 89, 5% incluidos ambos límites.

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12. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, que comprende al menos un regulador de pH, en un porcentaje en peso respecto al peso total de la composición comprendido entre 0, 05% y 0, 1%, incluidos ambos límites.

13. Composición según la reivindicación 11, que comprende al menos un regulador de pH, en un porcentaje en peso respecto al peso total de la composición comprendido entre 0, 005% y 0, 05%.

14. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 12 ó 13, donde el al menos un regulador de pH es seleccionado dentro del grupo compuesto por hidróxido sódico, hidróxido potásico y silicato trisódico.

15. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, que presenta la siguiente formulación:

- Rodamina B como agente de tinción, en un porcentaje en peso respecto al peso total de la composición del 0, 5%;

- N-óxido de C10-C16-alquildimetil amina como tensioactivo no iónico, en un porcentaje en peso respecto al peso total de la composición del 2, 4%;

-lauriléter sulfato sódico (LES) como tensioactivo aniónico, en un porcentaje en peso respecto al peso total de la composición del 4, 3%;

-ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) como agente quelante, en un porcentaje en peso respecto al peso total de la composición del 0, 4%;

- agua, en un porcentaje en peso respecto al peso total de la composición del 92, 3%;

- hidróxido de sodio como regulador de pH, en un porcentaje en peso respecto al peso total de la composición del 0, 01%.

16. Spray marcador de biofilms en superficies, que contiene la composición descrita en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

17. Procedimiento para identificar visualmente biofilms en superficies mediante la composición marcadora descrita en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, caracterizado por que comprende al menos las siguientes etapas:

- contactar la composición marcadora de biofilms con una superficie a analizar, y -aclarar la superficie con un solvente polar.

18. Procedimiento según la reivindicación anterior, donde el contacto entre la composición marcadora y la superficie se realiza mediante pulverización de la composición sobre la superficie con un spray que contiene la composición marcadora.

19. Procedimiento según la reivindicación anterior, donde el spray libera la composición en forma de espuma.

20. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores 17 a 19, donde el contacto entre composición y superficie tiene una duración comprendida entre 1 y 20 minutos, incluidos ambos límites.

21. Procedimiento según la reivindicación anterior, donde el tiempo de contacto está comprendido entre 2 y 10 minutos, incluyendo ambos límites.

22. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 17 a 21, donde este disolvente polar es agua o alcohol.