Composición de vacuna que comprende una proteína de unión a fibronectina o un péptido de unión a fibronectina.

Una composición que comprende

(a) al menos una proteína de unión a fibronectina,

y/o al menos una proteína de unión a fibronectina truncada y/o al menos un péptido de unión a fibronectina, que comprenden al menos un dominio de unión a fibronectina; y

(b) al menos un complejo de matriz iscom;

para su uso como vacuna contra mastitis en seres humanos, ganado, oveja o cabra, en donde dicha vacuna se administra por vía parenteral.

Composición de vacuna que comprende una proteína de unión a fibronectina o un péptido de unión a fibronectina.

La presente invención se refiere a una composición que comprende al menos una proteína de unión a fibronectina, y/o al menos una proteína de unión a fibronectina truncada y/o al menos un péptido de unión a fibronectina, que comprenden todos al menos un dominio de unión a fibronectina; y al menos un complejo de matriz iscom para su uso como vacuna contra mastitis en seres humanos, ganado, oveja o cabra, en donde dicha vacuna se administra por vía parenteral.

Antecedentes de la técnica SA es un patógeno, que provoca enfermedades en prácticamente todas las especies de mamíferos. SA es un patógeno importante en la especie bovina, ovina y caprina provocando sufrimiento y pérdidas económicas muy altas en las razas lecheras incluyendo ganado, oveja y cabras (reses) en todo el mundo. La mastitis inducida por SA puede ser el factor económico negativo más importante individual en medicina veterinaria debido a la patogenicidad incluyendo inflamación aguda y dolorosa grave, estados crónicos y persistentes y las dificultades con los tratamientos eficaces basados principalmente en antibióticos que pueden no funcionar debido a la resistencia que conduce a eliminación selectiva. La alternativa sería la vacunación, pero no existe ninguna vacuna eficaz hasta la fecha, que puede constituir la base para combatir el problema de mastitis provocado por SA.

Hay varios factores de patogenicidad para que una vacuna protectora prospectiva contra SA venza las infecciones. Por ejemplo SA “esconde” antígenos en la célula esenciales para la infección y para su supervivencia. Además, SA tiene la capacidad para manipular el sistema inmunitario del huésped para facilitar la existencia bacteriana. Esta situación compleja es uno de los motivos por los que no está disponible una vacuna frente a SA eficaz para la protección contra mastitis.

Los componentes de SA que manipulan y regulan por disminución la respuesta inmunitaria del huésped incluyen productos excretados tales como toxinas a y 1, leucocidina. También están implicados componentes unidos a células como superantígenos y proteína A.

Los ejemplos de estructuras esenciales que las bacterias esconden al sistema inmunitario del huésped que infecta son proteínas de unión a fibronectina (FnBp) o factor de fibrina externo (Ebf) esenciales para la adherencia de SA al tejido por ejemplo en heridas.

Se han aislado y caracterizado varios componentes de la superficie microbiana de unión a fibronectina que reconocen moléculas adhesivas de la matriz a partir de diferentes bacterias Gram-positivas. Se han clonado y secuenciado genes que codifican para componentes de la superficie microbiana de unión a fibronectina que reconocen moléculas adhesivas de la matriz de Staphylococcus aureus (Signas et al., “Nucleoside sequence of the gene for a fibronectin binding protein from Staphylococcus aureus: Use of this peptide sequence in synthesis of biologically active peptides”, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86:699-703, 1989.) , Streptococcus pyogenes (Talay et al., “Fibronectin-binding protein of Streptococcus pyogenes: Sequence of the binding domain involved in adherence of streptococci to epithelial cells”, Infect. Immun., 60:3837-3844, 1992.; Hansky et al., Infect. Immun., 60:5119-5125, 1992) y Streptococcus dysgalactiae (Lindgren et al., “Two different genes coding for fibronectin-binding proteins from Streptococcus dysgalactiae--the complete nucleotide sequence and characterization of the binding domains”, Eur. J. Biochem., 214:819-827, 1993) . Las secuencias de aminoácidos deducidas revelaron proteínas de 60-100 kDa con organización estructural muy similar. La secuencia señal N-terminal va seguida por un tramo largo de secuencia única, que en algunos casos está interrumpida por dos copias de un segmento de aproximadamente 30 aminoácidos de longitud. El sitio de unión a ligando está ubicado justo en posición N-terminal de un dominio rico en prolina, que se cree que ancla las proteínas en la pared celular. Este dominio va seguido por la secuencia LPXTGX que es una señal de direccionamiento a la pared celular (Schneewind et al., Science, 268:103-106, 1995. et al., 1995) , un tramo de residuos hidrófobos que representa una unidad transmembrana y un dominio citoplasmático C-terminal corto que contiene una agrupación de residuos cargados positivamente. Streptococcus agalactiae y Streptococcus uberis y Staphylococcus negativo para coagulasa tienen dispositivos de unión a fibronectina similares y son de especial interés para mastitis en la especie bovina y ovina. Además, los estafilococos negativos para coagulasa tienen FnBp y provocan mastitis. Los sitios de unión a fibronectina primarios en estos componentes de la superficie microbiana que reconocen moléculas adhesivas de la matriz consisten en motivos de 30-42 aminoácidos de longitud repetidos 3-4 veces, y la mayoría de las unidades repetidas contienen una secuencia consenso (Lindgren et al., 1993 en el lugar citado; McGavin et al., “Fibronectin receptors from Streptococcus dysgalactiae y Staphylococcus aureus: Involvement of conserved residues in ligand binding”, J. Biol. Chem. 268: 23946-23953, 1993) . Este dominio está compuesto por una unidad de 37-40 aminoácidos, repetidos tres o cuatro veces (figura 1 del documento USP 6.685.943) .

Por tanto, FnBp es una proteína de adhesión importante (antígeno) para la formulación de una vacuna protectora contra varias bacterias Gram-positivas incluyendo SA basándose en la función de adhesión e incluso más como diana para la fagocitosis que es el mecanismo protector principal contra SA. De manera importante, FnBp está presente en muchos aislados de bacterias Gram-positivas tales como Streptococcus pyogenes y/o Streptococcus dysgalactiae y Streptococcus agalactiae y Streptococcus uberis y Staphylococcus negativo para coagulasa, y Staphylococcus negativo para coagulasa. Casi el 100% de los aislados de SA. Una vacuna sería no sólo para la protección de vacas contra la mastitis provocada por infección por SA, sino también para prácticamente todas las especies animales afectadas por infecciones provocadas por SA incluyendo el hombre.

La composición de antígenos de vacuna puede variar en vacunas contra bacterias Gram-positivas, incluyendo infecciones por SA y enfermedad provocada por SA dependiendo de varios factores incluyendo cepas locales y cuadros clínicos. La adhesión a fibronectina media en un factor importante y común para el proceso de infección, y esta proteína está presente en prácticamente todos los aislados de SA. El bloqueo de la adhesión y neutralización es un efecto de IgG1 mediante anticuerpos, mientras que IgG2a es importante para la fagocitosis, el mecanismo protector inmunitario principal contra SA.

En vista del hecho de que SA es también un parásito intracelular, la rama mediada por células del sistema inmunitario (IMC) es un factor esencial. Está bien documentado que el sistema iscom potencia de manera potente la IMC y en particular a las células T citotóxicas que destruyen células infectadas, por ejemplo células infectadas por SA. Por tanto, las formulaciones de adyuvante basadas en la tecnología iscom tienen la capacidad para provocar varios mecanismos protectores inmunitarios.

Se han notificado iscom que contienen FnBp (Nickerson Nelson et al. 2000 (Symposium, Stresa Italia, Proceedings, 426-4319) . Se incorporó una FnBp en la matriz iscom para formar un iscom con antígeno integrado. Sin embargo, la formulación de iscom de Nelson no era suficientemente inmunogénica y no era útil para vacunas debido parcialmente a la corta duración de la inmunidad que inducía. La presente invención basada en liposomas o matriz iscom como adyuvante proporciona una inmunidad mucho mejor (véase el presente ejemplo 5 para comparación) . Además, la formulación de vacuna según esta invención se adecúa mucho mejor a la producción a gran escala, puesto que la tecnología iscom usada en esta invención requiere sólo la adición de matriz iscom a la suspensión de antígenos de vacuna.

Nelson et al. “Adhesins in Staphylococcal Mastitis as Vaccine Components”, Flemisch Veterinar y Journal, vol. 62, n.º 1, 1991, páginas 111-25 dan a conocer la inmunización de ratones con proteínas de fusión con dominios de unión a IgG y FnBp de proteína A de Stapholyococcus integradas en Iscoms. La inmunización realizada dos veces y una tercera vez durante la lactancia proporciona sólo una respuesta inmunitaria corta. Hay sólo respuesta de anticuerpos en suero y no en la ubre.

Pearse et al., “Iscomatrix® adjuvant for antigen deliver y ”,... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende

(a) al menos una proteína de unión a fibronectina, y/o al menos una proteína de unión a fibronectina truncada y/o al menos un péptido de unión a fibronectina, que comprenden al menos un dominio de unión a fibronectina; y

(b) al menos un complejo de matriz iscom;

para su uso como vacuna contra mastitis en seres humanos, ganado, oveja o cabra, en donde dicha vacuna se administra por vía parenteral.

2. La composición para su uso según la reivindicación 1, en donde la la proteína de unión a fibronectina, la proteína truncada y/o el péptido comprende uno o más dominios de unión a fibronectina de Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, o Staphylococcus negativo para coagulasa.

3. La composición para su uso según la reivindicación 1 ó 2, en la que el dominio de unión a fibronectina se selecciona del grupo que consiste en los dominios D de proteína de unión a fibronectina A o B de Staphylococcus aureus, los dominios A de proteína de unión a fibronectina A de Streptococcus dysgalactiae, los dominios B de proteína de unión a fibronectina B de Streptococcus dysgalactiae y los dominios P de proteína de unión a fibronectina de Streptococcus pyogenes.

4. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde la proteína de unión a fibronectina y/o proteína de unión a fibronectina truncada y/o péptido de unión a fibronectina se mezcla con matriz iscom o se acopla sobre matriz iscom.

5. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende además al menos otro antígeno.

6. La composición para su uso según la reivindicación 5, en donde los antígenos están en forma de células completas de y/o componentes antigénicos de microorganismos.

7. La composición para su uso según la reivindicación 6, en donde las células completas son células de Staphylococcus aureus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus agalactiae, Streptococcus uberis, o Staphylococcus negativo para coagulasa.

8. La composición para su uso según la reivindicación 6, en donde los componentes antigénicos se eligen de componentes que no regulan por disminución el sistema inmunitario, y componentes que regulan por disminución el sistema inmunitario.

9. La composición para su uso según la reivindicación 8, en donde el componente que no regula por disminución el sistema inmunitario se elige del grupo que consiste en adhesinas y factores de formación de poros.

10. La composición para su uso según la reivindicación 8, en donde el componente que regula por disminución el sistema inmunitario se elige del grupo que consiste en superantígenos, antígenos capsulares, endotoxinas, exotoxinas y enzimas extracelulares.

11. La composición para su uso según la reivindicación 9, en donde los factores de formación de poros se eligen del grupo que consiste en alfa-hemolisina, beta-hemolisina, gamma-hemolisina, delta-hemolisina, fosfolipasa C, elastasa de invasión tisular e hialuronidasa de invasión tisular.

12. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde el complejo de matriz iscom comprende uno o más fragmentos de glucósido de Quil A.

13. La composición para su uso según la reivindicación 12, en donde al menos dos fragmentos de glucósido de Quil A se complejan uniéndose en diferentes partícula de matriz iscom.

14. La composición para su uso según la reivindicación 12 ó 13, en donde el complejo de matriz iscom comprende el subfragmento A y /o el subfragmento C de Quil A.

15. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, en donde el complejo de matriz iscom comprende Quil A bruto.

16. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, que comprende además al menos un antígeno que afecta a la glándula mamaria.

17. La composición para su uso según una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, que comprende además un antibiótico, un portador farmacéuticamente aceptable, diluyentes, un excipiente o un aditivo.

5

Abr.