Compómeros específicos de dianas y procedimientos de uso.

Un procedimiento para determinar si una muestra contiene una molécula diana,

comprendiendo el procedimiento:

a) en condiciones de reacción, poner en contacto una muestra sospechosa de contener la molécula diana conun reactivo de detección de dianas para formar un complejo reactivo:diana, en el que el reactivo de detección de dianas comprende: un resto de unión a la diana que reacciona de forma específica con la molécula diana;y un molde de compómero, o un complemento del mismo, unido al resto de unión a la diana, en el que elmolde de compómero es una molécula de ácido nucleico que codifica un sustrato de escisión que comprendeun compómero que está correlacionado con la molécula diana que permanece aún independiente de lasecuencia o de la estructura de la molécula diana y que comprende solo una, dos, o tres subunidades deespecies de ribonucleótidos con la otra parte del sustrato de escisión que contiene una o más especies desubunidades de nucleótidos al menos una de las cuales no está presente en el compómero;

b) usar los complejos reactivo:diana, de existir, para transcribir sustratos de escisión a partir del molde decompómero,

c) escindir los sustrato de escisión para liberar los compómeros; y

d) determinar si los compómeros se han generado detectando la masa asociada con la composición de una,dos, o tres subunidades de especies de ribonucleótidos del compómero, determinando por tanto si la muestracontiene la molécula diana.

Compómeros específicos de dianas y procedimientos de uso Campo de la invención La presente invención se refiere, en general, al campo del análisis químico, y concierne a composiciones y procedimientos para detectar biomoléculas diana concretas, incluyendo moléculas de ácido nucleico. En particular, la invención se refiere a composiciones y procedimientos que permiten la detección indirecta y el análisis de biomoléculas concretas, por ejemplo, mediante espectrometría de masas.

Antecedentes de la invención 1. Introducción.

La siguiente descripción incluye información que puede ser útil para comprender la presente invención. No es una admisión de que dicha información sea técnica anterior, o relevante, para las invenciones actualmente reivindicadas,

o que cualquier publicación a la que se haga referencia de manera explícita o implícita sea técnica anterior.

2. Antecedentes La detección y el análisis eficaces de alta fidelidad de biomoléculas (por ejemplo, ácidos nucleicos, proteínas, hidratos de carbono, y lípidos) constituyen un importante desafío en biología. Estos desafíos son especialmente importantes en el contexto del análisis de muestras biológicas, que por su naturaleza son extremadamente complejas, tanto en términos del número de las diferentes especies moleculares presente, como en lo que respecta a los números de moléculas de las diferentes especies particulares. Debido a esta complejidad, se requieren procedimientos muy sensibles y selectivos para generar resultados válidos y reproducibles. Otro aspecto que complica el problema es la necesidad de obtener estos resultados de una forma comercialmente viable, por ejemplo, en términos de coste, tiempo, etc.

La importancia de abordar adecuadamente estos desafíos se considera mejor, quizás, en el contexto de la detección y el análisis a gran escala de ácidos nucleicos, que almacenan la información genética de todos los organismos vivos (por ejemplo, animales, plantas, y microorganismos) . En resumen, la información genética está codificada por lo general en ácido desoxirribonucleico (ADN) , aunque algunos virus contienen genomas hechos de ácido ribonucleico (ARN) . En los seres humanos, un genoma haploide complete contiene aproximadamente trescientos mil nucleótidos, e incluye aproximadamente 35.000 genes repartidos en 24 cromosomas (veintidós cromosomas somáticos y dos cromosomas sexuales) . Las moléculas de ADN y ARN naturales se sintetizan enzimáticamente como polímeros lineales de nucleótidos, que se diferencian entre sí solamente en términos de las bases incluidas en los nucleótidos particulares. En el ADN, se encuentran cuatro desoxirribonucleótidos diferentes, designados “A”, “G”, “C”, y “T” debido a la inclusión de una base de adenina, guanina, citosina, o timina en el desoxirribonucleótido particular. Análogamente, el ARN contiene cuatro ribonucleótidos diferentes, designados “A, “G”, “C”, y “U” debido a la inclusión de cualquiera entre una de una base de adenina, guanina, citosina, o uracilo. En la naturaleza, el ADN es bicatenario de forma típica, en el que una de las hebras del ADN está hibridada con la otra de forma antiparalela, de acuerdo con el emparejamiento de bases Watson-Crick canónico, en el que la A de una hebra siempre se une mediante un enlace de hidrógeno con la T de la otra hebra, y en que G se empareja siempre con C. Las mismas reglas de emparejamiento de bases se aplican al ARN, excepto en que en el ARN, U sustituye a T y por tanto se empareja con A (tanto en el ADN como en el ARN) .

En la naturaleza, la secuencia de nucleótidos de un ácido nucleico particular no es aleatoria, y es esa secuencia de nucleótidos particular la que distingue un miembro de una especie de otro miembro de la misma especie, así como un gen de otro gen. En general, cada gen codifica una proteína específica, aunque algunos genes finalmente codifican proteínas diferentes debido a las diferencias en el corte y empalme de los ARN mensajeros transcritos para el mismo gen. En cualquier caso, una vez que un gen que codifica una proteína se ha expresado mediante la transcripción y la traducción, la proteína codificada tiene una función específica en una célula viva.

Se sabe que, para un gen dado, o locus genético, pueden existir uno o más alelos. Los alelos de un gen dado se diferencian entre sí por diferencias en la secuencia de nucleótidos de cada alelo. Los alelos de un gen dado pueden surgir de la sustitución de un nucleótido por otro en una posición del nucleótido dada. Alternativamente, las diferencias entre alelos pueden ser debidas a la inserción o eliminación de uno o más nucleótidos en los diferentes alelos. Como resultado de estas diferencias en las regiones codificantes de proteína de un gen, las proteínas codificadas por los distintos alelos pueden diferenciarse por su tamaño y/o por su secuencia de aminoácidos. Con respecto a las proteínas que son enzimas, las diferencias en la secuencia de aminoácidos pueden dar por resultado diferencias en las velocidades catalíticas, especificidad de sustrato, necesidades de cofactores, estabilidad de la ubicación celular, pH óptimo, etc., parte de las cuales, o todas, pueden ser relevantes, por ejemplo, en el contexto de detección, prevención y tratamiento de enfermedades (por ejemplo, la adecuabilidad para administrar un fármaco concreto a un paciente en con interacciones fármaco/proteína específicas) . Por otra parte, si la (s) diferencia (s) entre alelos es (son) poca (s) debido a cambios en la región reguladora del gen, el nivel de expresión de las proteínas codificadas por los alelos concretos puede diferir, incluso de forma importante.

Los cambios en la secuencia de nucleótidos de una molécula de ácido nucleico genómico se produce como resultado de mutaciones en las que, durante la replicación y copia de un molde de ácido nucleico, no se obtiene como resultado una duplicación exacta del molde de ácido nucleico. Las mutaciones también pueden producirse durante la reparación del por ejemplo, de forma que una o ambas hebras del duplete de ADN se diferencian en su secuencia de nucleótidos cuando se comparan antes y después de una reacción de reparación. Como se ha indicado anteriormente, las mutaciones durante la replicación o la reparación incluyen la eliminación, inserción y/o sustitución de uno o más nucleótidos en una o ambas hebras del ADN bicatenario. Las mutaciones que implican la sustitución de un nucleótido por otro (por ejemplo, A por G) se han denominado mutaciones puntuales, ya que se han producido en la posición concreta de un nucleótido. En las regiones de codificación de proteína, una mutación puntual puede ser una mutación “de sentido incorrecto”, que da como resultado un cambio en el aminoácido codificado por el codón particular en el que se ha producido la mutación; una mutación “sin sentido”, en la que el cambio da como resultado que un codón cambia de uno que codifica un aminoácido a otro que codifica un codón de detención y por tanto conduce a una proteína truncada; o una mutación silenciosa, que da como resultado que el codón codifica el mismo aminoácido que antes. De nuevo, las mutaciones también se pueden suceder en las regiones no codificantes. Aunque este tipo de mutaciones no altera la secuencia de aminoácidos de la proteína codificada por el gen, puede afectar la regulación de la expresión del gen, la estabilidad de la molécula de ADN o de ARN, etc.

Si una mutación concreta persiste con el tiempo en una combinación de genes se determina por el proceso de selección natural, en el que los cambios que, con el tiempo mejoran la capacidad de supervivencia van a sobrevivir, mientras que los que no lo hacen desaparecen. Independientemente de los efectos evolutivos y que se han indicado anteriormente, las mutaciones pueden dar como resultado proteínas con actividades bioquímicas alteradas o, en algunos casos, incluso perdidas, lo que a su vez puede producir una enfermedad, una reacción adversa a un fármaco concreto, etc. Análogamente, las mutaciones pueden producir una regulación aberrante de la expresión génica, lo que también puede conducir a una enfermedad, una alteración en la sensibilidad a un fármaco, etc. debido a la abundancia relativa, en exceso o en defecto, de uno o más productos génicos concretos.

Las enfermedades producidas por mutación, tanto heredadas o producidas en el ADN de un sujeto concreto, se denominan como ‘enfermedades genéticas’ o similar. Se conocen en la actualidad más de 4000 enfermedades resultado de diferencias alélicas, incluyendo hemofilias, talasemias, distrofia muscular de Duchenne... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para determinar si una muestra contiene una molécula diana, comprendiendo el procedimiento:

a) en condiciones de reacción, poner en contacto una muestra sospechosa de contener la molécula diana con un reactivo de detección de dianas para formar un complejo reactivo:diana, en el que el reactivo de detección de dianas comprende: un resto de unión a la diana que reacciona de forma específica con la molécula diana; y un molde de compómero, o un complemento del mismo, unido al resto de unión a la diana, en el que el molde de compómero es una molécula de ácido nucleico que codifica un sustrato de escisión que comprende un compómero que está correlacionado con la molécula diana que permanece aún independiente de la secuencia o de la estructura de la molécula diana y que comprende solo una, dos, o tres subunidades de especies de ribonucleótidos con la otra parte del sustrato de escisión que contiene una o más especies de subunidades de nucleótidos al menos una de las cuales no está presente en el compómero;

b) usar los complejos reactivo:diana, de existir, para transcribir sustratos de escisión a partir del molde de compómero,

c) escindir los sustrato de escisión para liberar los compómeros; y

d) determinar si los compómeros se han generado detectando la masa asociada con la composición de una, dos, o tres subunidades de especies de ribonucleótidos del compómero, determinando por tanto si la muestra contiene la molécula diana.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el sustrato de escisión se escinde mediante un procedimiento seleccionado a partir del grupo que consiste en un procedimiento químico, físico, y enzimático.

3. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, en el que el molde de compómero comprende una molécula de ácido nucleico que comprende una unidad de transcripción que comprende una región promotora unida a una región de codificación que codifica mínimamente un compómero.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que la región promotora está seleccionada entre el grupo que consiste en una región promotora bacteriana, una región promotora de un bacteriófago, una región promotora consenso, una región promotora vírica y una región promotora eucariota.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que la región promotora es una región promotora de un bacteriófago seleccionada entre el grupo que consiste en una región promotora de T7, una región promotora de SP6, y una región promotora de T3.

6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el compómero es identificado mediante espectrometría de masas.

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el compómero es identificado en un intervalo de masas de 2500 a 10000 Daltons.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la molécula diana es un ácido nucleico seleccionado entre el grupo que consiste en una fuente de variación genética entre miembros de la misma especie y una molécula de ácido nucleico modificado químicamente.