Células del tejido adiposo extramedular y sus aplicaciones en la reconstitución del tejido cardiaco.

Uso de la fracción celular del estroma vascular del tejido adiposo extramedular,

para preparar un medicamento destinado al tratamiento de cardiomiopatías y de enfermedades en las que se observa una degeneración muscular cardiaca

Células del tejido adiposo extramedular y sus aplicaciones en la reconstitución del tejido cardiaco La presente invención se refiere a células derivadas del tejido adiposo extramedular, a sus procedimientos de preparación, así como a sus aplicaciones en la regeneración muscular cardiaca, en particular para el tratamiento de miopatías, cardiomiopatías y enfermedades asociadas con una degeneración muscular (infarto de miocardio) .

La regeneración del tejido muscular cardiaco (miocardio) se ha considerado bastante recientemente, ya que al contrario que los músculos esqueléticos, el corazón no tiene depósitos de células precursoras. Para regenerar el miocardio, se ha propuesto injertar células satélite autólogas en el corazón. Sin embargo, este procedimiento no es satisfactorio en la medida en que las células satélite injertadas se diferencian en células musculares esqueléticas que no tienen las mismas características contráctiles que los cardiomiocitos.

Por consiguiente, existe una necesidad real de disponer de nuevos medios y en particular de células capaces de regenerar el miocardio, que sean más eficaces y más sencillos de aplicar que los medios de la técnica anterior.

Recientemente se ha mostrado que los citoblastos de determinados tejidos no hematopoyéticos eran capaces de reconstituir todos los linajes hematopoyéticos de ratones, irradiados de forma letal, es decir:

- los citoblastos musculares derivados del músculo esquelético de ratones adultos expresan:

- o bien marcadores comunes a todos los citoblastos (Sca-1, c-Kit) pero no el marcador CD45, que es específico de citoblastos hematopoyéticos (Jackson y col., PNAS, 1999, 96, 14482-14486) ,

- o bien el receptor de la proteína morfogénica del tejido óseo de tipo 2 (BMP2) , (Pang, Blood, 2000, 95, 1106-1108) , y

- citoblastos neurales derivados de cerebro de ratón adulto (Bjornson y col., Science, 1999, 283, 534-537) .

De forma análoga, para obtener cardiomiocitos, se ha propuesto usar células embrionarias humanas, células mesenquimatosas de la médula ósea o células endoteliales (Kehat y col., J. Clin. Invest., 2001, 108, 407-414; Muller y col., FASEB J., 2000, 14, 2540-2548, Toma y col., Circulation, 2002, 105, 93-98; Liechty y col., Nat. Medicine, 2000, 11, 1282-1286; Condorelli y col., PNAS, 2001, 98, 10733-10738; Wang y col., J. Thorac. Cardiovasc. Surg 2001, 122, 699-705; Jackson y col., J. Clin. Invest., 2001, 107, 1395-1402) .

Se han propuesto dos hipótesis para explicar estos resultados: los citoblastos próximos a la totipotencia de las células embrionarias permanecerían en el tejido del adulto (cerebro, músculo...) y serían capaces de diferenciarse en diferentes tipos celulares, o bien los citoblastos especializados de estos tejidos tendrían una gran plasticidad y serían capaces de desdiferenciarse o de ser reprogramados (transdiferenciación) .

Estos resultados tienen consecuencias importantes para el tratamiento de deficiencias funcionales de la médula ósea (aplasia medular) , el tratamiento de la contaminación de la médula ósea por células tumorales (neuroblastoma) y para corregir anomalías genéticas de células hematopoyéticas (manipulación genética de tejido hematopoyético) . Estos resultados también tienen consecuencias para el tratamiento de deficiencias musculares funcionales (miopatías y cardiomiopatías) y de enfermedades asociadas a una degeneración muscular (infarto de miocardio) .

En efecto, el uso de citoblastos o de precursores de tejidos no hematopoyéticos permitiría evitar los problemas asociados con el rechazo de injerto de médula ósea o con una cantidad insuficiente de células CD34, en la medida en la que se podría considerar la reconstitución del líneas hematopoyéticas de un individuo adulto enfermo, por injerto de tejido nervioso o muscular autólogo extraído de este mismo individuo. Igualmente, el uso de citoblastos distintos de las células satélite, permitiría regenerar el miocardio por injerto de células de médula ósea, células embrionarias o células endoteliales.

Sin embargo, en la práctica, la regeneración del tejido muscular cardiaco a partir de las células citadas antes, difícilmente se puede realizar debido a dificultades técnicas en la extracción y a las pequeñas cantidades de tejidos disponibles. A estas dificultades técnicas se añaden igualmente los problemas éticos ligados al uso de tejidos embrionarios.

Por consiguiente, los autores de la invención se pusieron por objetivo proporcionar células capaces de reconstituir tejidos musculares de forma duradera, que sean aisladas de tejidos fáciles de extraer y disponibles en cantidades importantes.

El tejido adiposo existe en dos formas diferentes en los mamíferos: el tejido adiposo blanco que representa el órgano principal de reserva del organismo, el tejido adiposo pardo termogénico y el tejido adiposo medular cuya función exacta no se conoce.

Este tejido adiposo está constituido por dos fracciones celulares:

- una fracción de adipocitos que comprende células adiposas diferenciadas: adipocitos inmaduros (células adiposas pequeñas) y adipocitos maduros que representan de 30% a 60% de las células del tejido adiposo. Esta fracción celular se caracteriza por la acumulación de triglicéridos y la expresión de marcadores tardíos y muy tardíos como la GPDH (glicerol-3-fosfato deshidrogenasa) , y

-una fracción que no son adipocitos, llamada fracción del estroma vascular que comprende algunas células sanguíneas, endoteliales, pericitos, fibroblastos y precursores de adipocitos, en particular preadipocitos caracterizados por la ausencia de lípidos en su citoplasma y la expresión de marcadores precoces como la cadena a2 del colágeno VI (A2COL6/pOb24) y la lipoproteína lipasa (LPL) .

Estas dos fracciones celulares se pueden separar por su diferencia de densidad, según procedimientos tales como los descritos por Björntorp y col. (J. Lipid Res., 1978, 19, 316-324) .

De forma clásica, la diferenciación de los adipocitos se esquematiza de la siguiente forma: citoblastos multipotentes → precursor de adipocitos o preadipocito → adipocito inmaduro → adipocito maduro.

Los precursores muy precoces, es decir los citoblastos multipotentes capaces de generar diferentes tipos de células mesenquimatosas como las células adiposas y las células musculares, no se han identificado. Sin embargo, se ha mostrado que las líneas de las células mesenquimatosas eran capaces de diferenciarse en adipocitos, condrocitos o en fibroblastos, espontáneamente (línea de teratocarcinoma T984) o después de tratamiento con 5-azacitidina (10T1/2, 3T3, CHEF-18) .

Se han clonado precursores de adipocitos a partir de estas líneas celulares (línea clonal 1246) , a partir de un embrión de ratón (3T3-L1, 3T3-F442A, A31T, TA1) o de hámster (CHEF-18) o bien a partir de ratón adulto (Ob17, HFGu, BFC-1, ST13, MS3-2A, MC 3t3-G2/PA6) . Estos precursores de adipocitos son capaces de diferenciarse en adipocitos, in vitro o in vivo (Ailhaud y col., Annu. Rev. Nutr., 1992, 12, 207-233) .

Además, en trabajos anteriores (Cousin y col., The FASEB Journal, 1999, 13, 305-312) , los autores de invenciones que se han interesado en la relación entre los adipocitos y los macrófagos en la obesidad y la respuesta inflamatoria, han mostrado que los preadipocitos (cultivos primarios de la fracción del estroma vascular o la línea 3T3-L1) , como macrófagos, tienen una actividad de fagocitosis y que el marcador MOMA-2 que es específico de los monocitosmacrófagos es expresado también por los preadipocitos y los adipocitos. Sin embargo, se desprende de este articulo que los preadipocitos son diferentes de los macrófagos en la medida en que, por técnicas clásicas, no se puede detectar la presencia en la superficie de sus células de los marcadores F4/80 y Mac1 que son específicos de los macrófagos maduros.

El tejido adiposo tiene un potencial de regeneración que persiste durante toda la vida del individuo y está asociado al mantenimiento de una población de preadipocitos, dentro de diferentes depósitos adiposos. En efecto, el número de adipocitos presentes en un depósito dado varía en proporciones considerables según las condiciones fisiológicas o fisiopatológicas.

Por lo tanto, se ha mostrado que en el hombre o en los roedores adultos, de la misma edad, las células de la fracción del estroma vascular del tejido adiposo que comprenden una proporción importante de preadipocitos, que expresan marcadores precoces de diferenciación (A2COL6/pOb24, LPL, IGF-1....) son capaces de proliferar in vitro y de diferenciarse en adipocitos (Ailhaud y col., 1992, citado antes) .

Por... [Seguir leyendo]

1. Uso de la fracción celular del estroma vascular del tejido adiposo extramedular, para preparar un medicamento destinado al tratamiento de cardiomiopatías y de enfermedades en las que se observa una degeneración muscular cardiaca.

2. Células aisladas y purificadas, capaces de diferenciarse en cardiomiocitos, caracterizadas porque se pueden obtener mediante las siguientes etapas sucesivas:

-extracción de una muestra de tejido adiposo extramedular,

- aislamiento de la fracción celular del estroma vascular,

- cultivo de las células en un medio semisólido que contiene factores de crecimiento y/o citoquinas adecuados, y

- purificación de las células por separación física y/o por inmunoselección, y

porque expresan al menos un marcador de precursores de adipocitos seleccionado del grupo constituido por A2COL6/pOb24 y Pref-1 y al menos un marcador de precursores de cardiomiocitos seleccionado del grupo que comprende la a-actinina y el factor GATA-4.

3. Células según la reivindicación 2, caracterizadas porque dicho medio semisólido que contiene factores de crecimiento y/o citoquinas adecuados es un medio que contiene metilcelulosa complementada con suero fetal de ternero, suero bovino, insulina, transferrina, SCF (factor de células madre) , IL3 e IL6.

4. Células según la reivindicación 2 o la reivindicación 3, caracterizadas porque el aislamiento de la fracción celular del estroma vascular se realiza por digestión de la matriz extracelular por enzimas proteolíticas y por separación física.

5. Células según cualquiera de las reivindicación 2 a 4, caracterizadas porque la separación física se realiza basándose en la diferencia de adhesión sobre un soporte sólido adecuado.

6. Células según cualquiera de las reivindicación 2 a 5, caracterizadas porque expresan al menos A2COL6/pOb24.

7. Células según cualquiera de las reivindicación 2 a 6, caracterizadas porque son de origen humano.

8. Células modificadas, caracterizadas porque son células según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6 que están modificadas genéticamente.

9. Células modificadas según la reivindicación 8, caracterizadas porque comprenden al menos una mutación de un gen autólogo.

10. Células modificadas según la reivindicación 8, caracterizadas porque contienen al menos una copia de un gen heterólogo.

11. Células según cualquiera de las reivindicación 8 a 10, caracterizadas porque son de origen humano.

12. Líneas celulares inmortalizadas derivadas de células humanas según la reivindicación 7 o la reivindicación 11.

13. Medicamento destinado a la regeneración del miocardio, caracterizado porque comprende células según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7 o células modificadas o líneas derivadas de estas células según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, y al menos un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Uso de las células según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, o bien de las células modificadas o de las líneas derivadas de estas células según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, para preparar un medicamento destinado al tratamiento de cardiomiopatías y de enfermedades asociadas con la degeneración muscular cardiaca.

15. Procedimiento de preparación de células aisladas y purificadas capaces de diferenciarse en cardiomiocitos, como se define en cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, caracterizado porque dicho procedimiento comprende al menos las siguientes etapas:

a) extracción de una muestra de tejido adiposo extramedular,

b) aislamiento de la fracción celular del estroma vascular, preferiblemente por digestión de la matriz extracelular por enzimas proteolíticas, y por separación física, c1) cultivo de las células en un medio semisólido que contiene factores de crecimiento y/o citoquinas adecuados, y c2) purificación de las células por separación física y/o por inmunoselección.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque comprende la etapa adicional d) de expansión de las células in vitro.

17. Procedimiento según la reivindicación 15 o la reivindicación 16, caracterizado porque la inmunoselección se realiza con ayuda de un anticuerpo específico de un marcador expresado por dichas células tal como se definen en la reivindicación 2.

18. Uso de las células según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7 o bien de las células modificadas o de las líneas derivadas de estas células según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12, para el cribado de moléculas capaces de modular la actividad muscular cardiaca.

19. Procedimiento de preparación de cardiomiocitos, caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a) cultivo de células purificadas y aisladas a partir de la fracción celular del estroma vascular del tejido adiposo extramedular, en un medio semisólido que contiene factores de crecimiento y/o citoquinas adecuados, y

b) selección de las células que presentan actividad contráctil espontánea.

20. Procedimiento según la reivindicación 19, caracterizado porque la etapa b) comprende la selección de dichas células cuya actividad contráctil es inhibida de forma reversible por un agonista de receptores muscarínicos de la acetilcolina.

21. Procedimiento según la reivindicación 19, caracterizado porque la etapa b) comprende la selección de dichas células cuya frecuencia de contracción es estimulada de forma reversible por un agonista de receptores 1adrenérgicos.

22. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 21, caracterizado porque dicho medio semisólido es metilcelulosa.

23. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 19 a 22, caracterizado porque dichos factores de crecimiento y/o citoquinas adecuados son suero fetal de ternero, suero bovino, insulina, transferrina, SCF, IL3 e IL6.