Células de Saccharomyces cerevisiae secas, liofilizadas y/o microencapsuladas con un alto contenido de (S)-(+)-S-adenosil-metionina.

Composiciones farmacéuticas que contienen:

a) células de la cepa de Saccharomyces cerevisiae secas y/o microencapsuladas depositadas en la colección DBVPG bajoel número DBVPG 8 P que tiene un contenido de (S)-(+)-S-adenosil-L-metionina de 7%-20% p/p seco en donde (R)-(+)-Sadenosil-L-metionina está en una cantidad inferior que o igual a 10% de (S)-(+)-S-adenosil-L-metionina,

dicha (S)-(+)-Sadenosil-L-metionina está en forma de una base libre, y,

b) excipientes adecuados,

en forma seca o en forma microencapsulada.

Células de Saccharomyces cerevisiae secas, liofilizadas y/o microencapsuladas con un alto contenido de (S) - (+) -S-adenosilL-metionina Esta invención se relaciona con las células de Saccharomyces cerevisiae secas, liofilizadas y/o microencapsuladas con un alto contenido de (S) - (+) -S-adenosil-L-metionina, un proceso para su preparación, y composiciones que contienen dichas células.

Particularmente, la invención se relaciona con las células de Saccharomyces cerevisiae en donde el diastereoisómero, de base libre, (R) - (+) -S-adenosil-L-metionina (de aquí en adelante llamado (R) - (+) -SAMe) está en una cantidad inferior que o igual a 10% del diastereoisómero, de base libre, (S) - (+) -S-adenosil-L-metionina (de aquí en adelante llamado (S) - (+) -SAMe) .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Se conoce que el ión (S) - (+) -SAMe es muy inestable y por consiguiente se degrada rápidamente si se extrae de las células productoras. De hecho, muchos años pasaron entre el descubrimiento de SAMe (Cantoni y otros "Phosphorous metabolism", Baltimore 1952 2, 129; Cantoni y otros J. Biol. Chem, 1953, 204, 403) y su comercialización. El problema de la estabilidad se resolvió inicialmente por salificación, particularmente en forma de sulfatos. Sin embargo, las sales de sulfato de SAMe algunas veces causan efectos secundarios, especialmente en la mucosa gástrica, debido a su acidez inherente.

Se conoce que (R, S) SAMe es un dador fisiológico de grupos metilo involucrados en reacciones enzimáticas de transmetilación, la cual está presente en todos los organismos vivos y tiene efectos terapéuticos en trastornos crónicos del hígado, adiposis, lipemia y aterosclerosis.

Se conoce además que (J.W. Cornforth, J.A.C.S., 1977, 99, 7292-7300; Stolowitz y otros, J.A.C.S., 1981, 103, 6015-6019) que los productos que contienen (R, S) SAMe consistn de una mezcla de dos diastereoisómeros: (R) - (+) -SAMe y (S) - (+) -SAMe, que tiene la siguiente estructura molecular:

Se demostró además (De La Haba y otros, J.A.C.S. 1959, 81, 3975-3980) que solamente uno de los dos diastereoisómeros, es decir, (S) - (+) -SAMe, es enzimáticamente activo por transmetilación y racemización espontánea, y por lo tanto genera la formación del diastereoisómero inactivo (R) - (+) -SAMe que representa aprox. 20% (Wu y otros, Biochemistr y 1983, 22, 282835 2832) .

Se observó que en todos los productos disponibles en el mercado que contienen SAMe, el diastereoisómero inactivo (R) - (+) -SAMe está presente en una cantidad de al menos 20%; se observó además que dichos porcentajes aumentan con el tiempo hasta 40% y más debido a la racemización espontánea.

Las células tienen un contenido natural de (S) - (+) -SAMe igual a aprox. 100%, pero la metodología de extracción y

purificación industrial produce un producto parcialmente degradado, y por lo tanto una mezcla de ; 20% (R) - (+) -SAMe y S 80% (S) - (+) -SAMe Estos factores confirman claramente que la mezcla de diastereoisómeros es inestable con el tiempo, y esto se conocía ya con relación al producto en solución (G.L. Creason y otros, Phytochemistr y , vol. 24, N. 6, 1151-1155, 1985; H.C. Uzar, Liebigs Ann. Chem. 1989, 607-610) .

Se observó además que (R, S) SAMe, y sus formas salificadas aprobadas para uso farmacéutico, presentan problemas de inestabilidad, adicionalmente a la complejidad de los procesos de preparación y purificación.

Los procesos de purificación conocidos involucran el uso de resinas de ácido fuerte (JP 13680/1971) , resinas quelantes (JP 20998/1978) o reactivos especiales costosos, tales como ácido pícrico o picolínico (US 3707536 y US 3954726) ; sin embargo, ellos conducen a la racemización parcial del azufre de SAMe y por lo tanto a la producción de los productos finales que contienen el diastereoisómero inactivo en una cantidad que excede 20%.

Sin embargo, los procesos de purificación que involucran el uso de resinas de ácido débil (JP 14299/1981, FR-A-2531714, EP-A-0141914) solamente permiten la separación parcial del diastereoisómero activo a ser obtenido, y por lo tanto un grado de pureza insuficiente para los propósitos farmacéuticos.

Aunque el desempeño de alguno de dichos procesos permite obtener una pureza mayor, racemización parcial implica, en cualquier caso, que al menos 20% del diastereoisómero activo esté presente; además, en algunos casos (FR 2531714) , se usa bicarbonato potásico para extraer el producto de las células, con la consecuente precipitación del porclorato potásico, que causa dificultad con la separación y posterior eliminación del producto. En EP-A-0141914, la lisis de las células de levadura que contienen SAMe se realiza en presencia de un solvente orgánico (tal como acetato de etilo, acetona, etc.) , además usando columnas cromatográficas que requieren el uso de resinas conun tamaño de partícula de 100-200 mesh, que involucran las inversiones pesadas y costes de mantenimiento para la regeneración y lavado.

El uso de solventes para extraer el SAMe necesariamente involucra el uso de plantas resistentes al fuego, recuperación de solvente y sistemas de destilación, así como la separación y secado necesario de la biomasa agotada, para prevenir que se elimine junto con el solvente residual. Todos estos factores involucran claramente un aumento en el gasto y coste de las operaciones.

Existe por tanto una necesidad de derivados o formas de dosificación de SAMe en donde el porcentaje del diastereoisómero activo (S) - (+) -SAMe es claramente mayor que el isómero inactivo (R) - (+) -SAMe, y en donde dicho porcentaje es estable en el tiempo.

Morana y otros, Biochimica et Biophysica Acta, 2002, vol. 1573 (2) , 105-108, describen el uso de trehalosa como agente estabilizante de SAMe dentro de las células de S. cerevisiae.

US 4 562 149 y WO 2004/005450 describen la preparación de SAMe por fermentación de cepas de S. cerevisiae de alta productividad.

US 3 962 034 describe que las células de levadura usadas en la producción de SAMe pueden ser usadas como aditivos de la alimentación.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Se descubrió ahora que la base libre de SAMe es estable dentro de la célula productora. La protección proporcionada por la pared de la célula intacta de la levadura promueve además mayor estabilidad con el tiempo a temperatura ambiente.

Esta invención por lo tanto se relaciona con células de la cepa de Saccharomyces cerevisiae GNL 24/497 secas o microencapsuladas, que se depositaron en la colección DBVPG para los propósitos de la patente de acuerdo con el Tratado de Budapest de fecha 27 de abril de 2005, bajo el número de acceso DBVPG 8P, con un contenido de (S) - (+) -5-adenosil-Lmetronina de 7%-20% p/peso seco caracterizado además porque (R) - (+) -S-adenesil-L- metionina está en una cantidad inferior que o igual a 10% de (S) - (+) -S-adenosil-L-metionina.

Las células de acuerdo con la invención pueden administrarse como tal en formas farmacéuticas adecuadas, especialmente cápsulas, tabletas, tabletas gastro-resistantes y similares.

La productividad SAMe de la cepa GNL24/497, es 2, 0%-6, 0% p/peso seco, más específicamente 3%-4% p/p seco, al final de la fermentación, y 7%-20% p/p seco, y más específicamente 10%-16% p/p seco, al final de la etapa de enriquecimiento.

La levadura Saccharomyces cerevisiae GNL24/497 se clasificó como tal por la Universidad de Perugia "DBVPG Colección de Levaduras Industriales" sobre la base de sus características morfofisiológicas y por la técnica de reassociación de ADN-ADN.

La levadura se cultiva a nivel industrial de acuerdo con técnicas y condiciones conocidas, y se usada para preparar biomasas de panificación en donde DL metionina en la cantidad de 0, 5%-4, 0% p/v, más específicamente 1, 0%-3, 0% p/v, se añade al medio de cultivo ordinario basado en las melazas (F. Schlenk y R.E. De Palma, J. Biol. Chem. 1957 229, 1051; F. Schlenk, J.L. Dainko y S.M. Stanford, Archives of Biochemistr y and Biophysics 1959, 83, 28-34) .

La biomasa se recoge por centrifugación, se lava, se resuspende y se somete a un proceso de activación en un medio (de aquí en adelante llamado "el medio de activación") que contiene fosfato de potasio; sulfato de amonio; citrato sódico; sales de magnesio, manganeso, cinc y calcio; glucosa y L-metionina r DL-metionina (F. Schlenk y R.E. De Palma, J. Biol. Chem, 1957, 229, 1051F. Schlenk y otros, Enzymologia 29, 283, 1965) .

El proceso de activación puede repetirse 2-5 veces, más específicamente 2-3 veces, bajo condiciones estériles o no estériles; a presión atmosférica o bajo ligera presión; a un pH controlado o pH libre; con aireación de 0, 1-1, 5 v/v/m, o más... [Seguir leyendo]

1. Composiciones farmacéuticas que contienen:

a) células de la cepa de Saccharomyces cerevisiae secas y/o microencapsuladas depositadas en la colección DBVPG bajo el número DBVPG 8 P que tiene un contenido de (S) - (+) -S-adenosil-L-metionina d.

7. 20% p/p seco en donde (R) - (+) -Sadenosil-L-metionina está en una cantidad inferior que o igual a 10% de (S) - (+) -S-adenosil-L-metionina, dicha (S) - (+) -Sadenosil-L-metionina está en forma de una base libre, y, b) excipientes adecuados, en forma seca o en forma microencapsulada.

2. Composiciones como las reivindicadas en la reivindicación 1, en forma de tabletas, gastro-resistentes tabletas y cápsulas.

3. Composiciones como las reivindicadas en la reivindicación 1 o 2, con un contenido del constituyente activo de (S) 15 (+) -S-adenosil-L-metionina de entre 100 y 400 mg.

4. Células de la cepa de Saccharomyces cerevisiae secas y/o microencapsuladas depositadas en la colección DBVPG bajo el número DBVPG 8 P que tiene un contenido de (S) - (+) -S-adenosil-L-metionina d.

7. 20% p/p seco en donde (R) - (+) -S-adenosil-L-metionina está en una cantidad inferior que o igual a 10% de (S) - (+) -S-adenosil-L-metionina,

dicha (S) - (+) -S-adenosil-L-metionina está en forma de una base libre como forma de dosificación para la administración oral de (S) - (+) -S-adenosil-L-metionina.