CBH1.1 de Humicola grisea variante.

Un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa I, donde el polipéptido es una variantede CBH1.

1 de H. grisea que presenta la secuencia mostrada en la Figura 4 (SEQ ID Nº:4).

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a polipéptidos que presentan actividad de celobiohidrolasa I

(también denominados CBH I o CBH1) y polinucleótidos que tienen una secuencia de nucleótidos que codifica para los polipéptidos. La invención también hace referencia a construcciones de ácido nucleico, vectores y células huésped que contienen construcciones de ácido nucleico, así como métodos para producir y utilizar los polipéptidos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La celulosa es una materia prima industrial importante y una fuente de energía renovable. La estructura física y la morfología de celulosa nativa son complejas y ha sido difícil determinar los detalles precisos de su estructura de forma experimental. No obstante, la composición química de la celulosa es simple, compuesta de residuos de D-glucosa enlazados por uniones de beta-14glicosídicas para formar cadenas lineales.

Con el fin de ser eficaz, la digestión de celulosa requiere que muchos tipos de enzimas actúen de modo cooperativo. Al menos tres categorías de enzimas son necesarias para convertir celulosa en glucosa: endo (1, 4) -beta-D-gluconasas (EC 31.4) que cortan las cadenas de celulosa al azar; celobiohidrolasas (EC 31.91) que dividen unidades de celobiosil de los extremos de la cadena de celulosa y beta-glucosidasas (EC 31.21) que convierten la celobiosa y las celodextrinas solubles en glucosa. Entre estas tres categorías de enzimas implicadas en la biodegradación de celulosa, las celobiohidrolasas son las enzimas clave para la degradación de la celulosa cristalina nativa. [0004] Las exo-celobiohidrolasas (Celobiohidrolasa 1 o CBH 1) se refieren a las celobiohidrolasas que degradan celulosa hidrolizando la celobiosa del extremo no reductor de las cadenas de polímeros de celulosa.

Es un objetivo de la presente invención lograr polipéptidos mejorados que tienen actividad de celobiohidrolasa I y polinucleótidos que codifican polipéptidos. Los polipéptidos mejorados pueden haber mejorado la actividad específica y/o la estabilidad, en concreto la termoestailidad. [0006] Takashima S et al., JOURNAL OF BIOTECHNOLOGY, vol. 50, nº 2, 1 de octubre de 1996, págs.137-147, presenta la clonación, secuenciación y expresión de genes de celulasa de una cepa de Humicola grisea var. thermoidea. [0007] Oliveira Azevedo De Metal, NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 18, nº 3, 1 de enero de 1990, pág. 668, divulga la secuencia de un gen de cbh-1 (núm. de acceso del Laboratorio Europeo de Biología Molecular (EBML) X17258) de una cepa de Humicola grisea var. thermoidea. [0008] Aunque las composiciones de celulasa se han descrito previamente, todavía se necesitan nuevas y mejoradas composiciones de celulasas para su uso en detergentes domésticos, composiciones para el lavado a la piedra o detergentes de lavandería, etc. Son de gran interés las celulasas que muestran un mejor rendimiento.

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BREVE RESUMEN

En un primer aspecto, la presente divulgación se refiere a un polipéptido que muestra actividad

de celobiohidrolasa I, seleccionada del grupo que consta de:

a) variante de CBH1 de H. grisea derivada de CBS 225.36.

b) variante de CBH1.1 de H. grisea que presenta la secuencia mostrada en la Figura 3.

c) variante de CBH1.1 de H. grisea que presenta la secuencia mostrada en la Figura 4.

d) variante de CBH1 de Hypocrea jecorina como se describe aquí; y

e) CBH1 de Scytalidium thermophilium derivada de CBS 671.88 [0011] En el segundo aspecto, la presente invención hace referencia a un polinucleótido que codifica una variante de CBH1.1 de H. grisea, una variante de CBH1 de H. jecorina o una CBH1 de S.

thermophilium. En un modo de realización, el polinucleótido que codifica una variante de CBH1.1 de H. grisea se deriva de CBS 225.63. En otro modo de realización, el polinucleótido codifica una variante de CBH1.1 de H. grisea mostrada en la Figura 3. En otro modo de realización, el polinucleótido codifica una variante de CBH1.1 de H. grisea presentada en la Figura 4. [0012] En un modo de realización general, un polinucleótido que codifica una variante de CBH1.1 de

H. grisea, una variante de CBH1 de H. jecorina o una CBH1 de S. thermophilium tiene al menos 90%, preferentemente 95%, 98% o más de identidad de secuencia con las secuencias que codifican CBH1 de S. thermophilium, una variante de CBH1 de H. jecorina o una variante de CBH1.1 de H. grisea presentadas en el presente documento utilizando un programa de alineamiento de secuencias. [0013] En un tercer aspecto, la presente invención se refiere a una construcción de ácido nucleico que comprende la secuencia de nucleótidos, que codifica para la variante de CBH1.1 inventiva, una variante de CBH1 de H. jecorina o una CBH1 de S. thermophilium, unida de modo funcional a una o más secuencias de control que dirigen la producción de la variante de CBH1.1, variante de CBH1 de

H. jecorina o CBH1 de S. thermophilium en un huésped adecuado. [0014] En una cuarta realización, la presente invención hace referencia a un vector de expresión recombinante que comprende la construcción de ácido... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido que tiene actividad de celobiohidrolasa I, donde el polipéptido es una variante de CBH1.1 de H. grisea que presenta la secuencia mostrada en la Figura 4 (SEQ ID Nº:4) .

2. El polipéptido de la reivindicación 1, que también comprende una secuencia señal.

3. El polipéptido de la reivindicación 2, compuesto por una variante de CBH1.1 de H. grisea que presenta la secuencia de la Figura 3 (SEQ ID Nº:3)

4. Un polinucleótido que codifica una celobiohidrolasa que consta de una variante de CBH1.1 de H. grisea que comprende la SEQ ID Nº:4.

5. Un polinucleótido según la reivindicación 4, en el que la variante de CBH1.1 de H. grisea 10 comprende la SEQ ID Nº:3.

6. Una construcción de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 4, unida de modo funcional a una o más secuencias de control.

7. Un vector de expresión recombinante que comprende la construcción de ácido nucleico de la reivindicación 6.

8. Una célula huésped recombinante que comprende la construcción de ácido nucleico de la reivindicación 6.

9. Un método para la producción de un polipéptido de CBH1, dicho método comprende: a) la transformación de una célula huésped con un ácido nucleico que consta de un polinucleótido según la reivindicación 4;

b) el cultivo de una célula huésped en condiciones para producir el polipéptido; y c) la recuperación del polipéptido.

10. Una composición que comprende un polipéptido que presenta actividad de celobiohidrolasa I según la reivindicación 1.

11. Un método para convertir biomasa en azúcares que comprende la puesta en contacto de la

biomasa con un polipéptido que presenta actividad de celobiohidrolasa I, en el que dicho polipéptido tiene actividad mejorada con respecto a T. reesei, ya sea en un ensayo de conversión de PCS a 65°C o en un ensayo de PASC a 38°C, y en el que el polipéptido comprende una variante de CBH1.1 de H. grisea que presenta la secuencia de la Figura 4 (SEQ ID Nº:4) .

CBH1.1 de H. grisea Figura 1: Secuencia genómica total (1638 nucleótidos)

Figura 2: Secuencia de intrón putativo eliminada (GTACGTT….CAG .

41. 472) Proporciona la secuencia de ADNc (1578 nucleótidos)

Figura 3: La traducción de la secuencia de ADNc proporciona la secuencia de proteínas (525 aminoacidos) del precursor de CBH1 de H. grisea var thermoidea (es decir, con secuencia señal) :

Figura 5. Alineamiento de secuencia de dos secuencias públicas y CBH1.1 de H. grisea variante.

:

:

Figura 14A ADN genómico de CBH1 de Scytalidium thermophilium

Figura 14B ADNc de CBH1 de Scytalidium thermophilium

Figura 14C CBH1 de Scytalidium thermophilum, incluyendo la secuencia señal

Figura 15: Alineamiento de las secuencias de proteína madura para CBHI de Hypocrea jecorina, CBH1.1 de Humicola grisea var. thermoidea y CBH de Scytalidium thermophilum