Biomarcadores de cáncer.

Un método de diagnóstico o monitorización de la progresión de cáncer de próstata que comprende cuantificar odetectar la cantidad de al menos un factor de transcripción que contiene homeodominio,

o un fragmento del mismo,en orina y compararlo con la cantidad de dicho al menos un péptido en una muestra de ensayo de orina con lacantidad presente en una muestra de orina de control normal procedente de un sujeto normal sin cáncer, donde elfactor de transcripción que contiene homeodominio es un péptido EN-2 que comprende la SEQ ID NO: 4, y donde elfragmento tiene al menos un 80% de homología de secuencia con respecto a la SEQ ID NO: 4, más preferiblementeun 85%, más preferiblemente un 90%, más preferiblemente un 95%, más preferiblemente un 97%, máspreferiblemente un 99% y lo más preferiblemente un 99,9% de homología de secuencia con respecto a dicha SEQID NO: 4, donde un aumento del nivel del al menos un factor de transcripción que contiene homeodominio, o de unfragmento del mismo, que se observe en la muestra de ensayo es indicativo de que la enfermedad está en progresoo de que se ha iniciado.

Biomarcadores de cáncer

La presente invención se refiere al uso de al menos un homeodominio que contiene factor de transcripción, tal como péptido HOX o péptido EN-2, como biomarcador para cáncer de próstata.

El cáncer de próstata es actualmente la principal causa de muerte relacionada con cáncer entre los hombres, siendo responsable de la muerte de 10.000 hombres al año solo en el Reino Unido. Sin embargo, la disponibilidad actual de biomarcadores para la detección no invasiva del cáncer de próstata está limitada esencialmente al Antígeno Específico de Próstata (PSA, del inglés “Prostate Specific Antigen”) . Los niveles en suero de PSA se ven incrementados significativamente en pacientes con cáncer de próstata, y actualmente se usa el test de PSA para seguir la evolución de la enfermedad y su respuesta frente a un tratamiento.

Desafortunadamente, existe una serie de desventajas significativas con el test de PSA. Puesto que los niveles de PSA se ven incrementados significativamente en otras afecciones no cancerígenas de la próstata, tal como la prostatitis y la hipertrofia benigna, no siempre es seguro que la detección de un aumento de los niveles de PSA sea realmente indicativa de un cáncer de próstata en un paciente. Adicionalmente, los niveles de PSA no se correlacionan necesariamente con el volumen de la enfermedad o con el desarrollo de metástasis nodal u ósea.

Recientes intentos de usar otros indicios como la relación de PSA libre a PSA total y la “velocidad de PSA” han demostrado no ser válidos, debido al muy alto nivel de falsos positivos, que da como resultado un gran número de biopsias invasivas innecesarias.

De hecho, se cree que los niveles de PSA se elevan solo de forma muy lenta en el cáncer de próstata, de tal modo que la enfermedad a menudo está muy avanzada antes de obtener un resultado positivo, cuando se miden los niveles de PSA. Además, los niveles de PSA deben ser normalizados, ya que puede variar con la edad y el tamaño de la próstata.

También existe una serie de marcadores químicos potenciales adicionales del cáncer de próstata, que incluyen las calicreínas, y más recientemente, los fragmentos de 80 kDa de la e-caderina (Kuefer et al., 2005) . Nuevamente, dichos biomarcadores tienden a presentar muchas de las desventajas significativas discutidas anteriormente en relación al PSA.

Morgan et al. (Proc. Amer. Cancer Res. Vol. 47, 2006, p. 622) describe que EN-2 se transcribe tanto en la línea celular derivada de cáncer de próstata (LNCaP) , como en las células de cáncer de próstata primarias. La proteína EN-2 también está presente dentro de dichas células, y en el medio de cultivo, en concurrencia con estudios previos que demuestran que la EN-2 es secretrada.

Bose et al. (Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. Vol. 48, 2007, p. 503) describen que EN-2 se expresa de forma aberrante en células de cáncer humano en comparación con células de próstata normales.

Por lo tanto, existe una necesidad en la técnica de un biomarcador de cáncer de próstata fiable.

Sorprendentemente, hemos descubierto que el factor de transcripción homeótico, HOXC4, es secretado desde tumores de próstata y su concentración en suero es significativamente elevada en pacientes de cáncer de próstata. Por tanto, la presencia de HOXC4 en fluidos corporales, tales como el suero, es un indicador útil de cáncer de próstata tanto en etapa temprana como en etapa avanzada.

También hemos descubierto que una segunda proteína HOX, la HOXB6, y una tercera proteína HOXB5, también presentan resultados similares. La HOXA3 y la HOXD9 también son consideradas útiles como biomarcadores.

Además hemos identificado el factor de transcripción que contiene homeodominio Engrailed 2 (EN-2) como expresado tanto a nivel de ARN como de proteína en las líneas celulares derivadas de cáncer de próstata LNCaP y PC3, y también en células de cáncer de próstata primarias. Además, la proteína EN-2 puede ser secretada en el medio circundante de las células.

Sorprendentemente, se podrían detectar niveles elevados de todos estos marcadores de cáncer en pacientes de cáncer de próstata incluso cuando se obtenían niveles normales de PSA. Esto ilustra adicionalmente que los marcadores de la presente invención son más fiables en la diagnosis de cáncer de próstata que otros marcadores, tales como PSA.

Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona el uso de al menos un factor de transcripción que contiene homeodominio, o un fragmento del mismo, como biomarcador para cáncer de próstata. Los ejemplos de factores de transcripción que contienen homeodominio incluyen péptidos de EN-2. La invención también se refiere a un método para diagnosticar la enfermedad de cáncer de próstata que comprende detectar al menos un factor de transcripción que contiene homeodominio en una muestra procedente de un paciente.

Se prefiere particularmente que el al menos un péptido EN-2, o fragmento del mismo, sea detectable en un fluido corporal.

Preferiblemente, el biomarcador es solo EN-2. Sin embargo, también se prefieren combinaciones. Dichas combinaciones incluyen EN-2 y HOXC4; EN-2 y HOXB5; EN-2 y HOXB6; EN-2, HOXC4 y HOXB5; EN-2, HOXC4 y HOXB6; EN-2, HOXB5 y HOXB6; EN-2, HOXC4, HOXB5 y HOXB6. Dichas combinaciones también pueden comprender adicionalmente uno o ambos de HOXA3 y/o HOXD9. Combinaciones adicionales incluyen HOXA3 y HOXD9; HOXA3 y HOXC4; HOXA3 y HOXB5; HOXA3 y HOXB6; HOXA3 y EN-2; HOXD9 y HOXC4; HOXD9 y HOXB5; HOXD9 y HOXB6 y EN-2. Una combinación particularmente preferida de marcadores comprende uno o más, preferiblemente todos, de HOXC4, HOXB5, HOXB6 y EN-2.

Preferiblemente, el fluido corporal es suero u orina.

Los genes HOX son una familia de factores de transcripción que contienen homeodominio que determinan la identidad de células y tejidos durante el desarrollo inicial (revisión de Morgan, 2006) . Publicaciones recientes, que incluyen Miller et al 2003, han identificado de manera eficaz todas las proteínas que se expresan, y que son retenidas intracelularmente, en una célula tumoral de cáncer de próstata. Por supuesto, esto significa que se identificaron un total de entre 10.000 y 12.000 proteínas, incluyendo los péptidos HOX.

Sin embargo, sorprendentemente hemos descubierto que, entre estos miles de proteínas expresadas en las células de cáncer de próstata, la proteína HOXC4, por ejemplo, se encuentra extracelularmente y es un excelente biomarcador para el cáncer de próstata.

Esto es sorprendente por una serie de razones. En primer lugar, HOXC4 es un factor de transcripción y, por tanto, no sería esperable encontrarlo en el suero. En segundo lugar, aunque se conocen otros biomarcadores para el cáncer de próstata, encontrar un biomarcador fiable ha sido una misión infructuosa, véanse por ejemplo los problemas descritos anteriormente en relación al PSA. De hecho, HOXC4 es un biomarcador tanto de etapa temprana como, en particular, de etapa avanzada, tal como se muestra en la Figura 1.

Por tanto, esta proteína no ha sido identificada como biomarcador para el cáncer de próstata antes, aunque se sabe que se expresa en células de cáncer de próstata, junto con muchos miles de otras proteínas, muchas de las cuales no podrían ser descritas como biomarcadores para el cáncer de próstata. Esto también se aplica a otros péptidos HOX, que incluyen HOXB5 y HOXB6.

Como los péptidos HOX, las proteínas Engrailed (En) también son factores de transcripción que contienen homeodominio que muestran un grado muy elevado de conservación funcional durante el desarrollo (revisado por Morgan, 2006) . El gen En original fue caracterizado en Drosophila, donde el mutante En no consigue formar una frontera entre el ala anterior y posterior (Garcia-Bellido y Santamaria, 1972) . Del mismo modo, los homólogos de vertebrados de En presentan roles reguladores durante el desarrollo, que incluye el desarrollo de miembros y la especificación temprana y las migraciones axonales subsiguientes del sistema nervioso (Morgan, 2006) .

Además de la regulación transcripcional, las proteínas EN tienen una serie de propiedades adicionales, aparentemente no relacionadas, que son importantes funcionalmente. La primera de ellas es la capacidad para ser secretadas desde las células, y para ser internalizadas por parte de otras (Cosgaya et al, 1998; Joliot et al, 1998, revisado por Morgan, 2006) . La base mecanística exacta para este fenómeno es desconocida, aunque está claro que depende de la secuencia de exportación nuclear conservada localizada en el homeodominio (Maizel et al, 1999; Chatelin et al, 1996; Derossi et al, 1996; Joliot... [Seguir leyendo]

1. Un método de diagnóstico o monitorización de la progresión de cáncer de próstata que comprende cuantificar o detectar la cantidad de al menos un factor de transcripción que contiene homeodominio, o un fragmento del mismo, en orina y compararlo con la cantidad de dicho al menos un péptido en una muestra de ensayo de orina con la cantidad presente en una muestra de orina de control normal procedente de un sujeto normal sin cáncer, donde el factor de transcripción que contiene homeodominio es un péptido EN-2 que comprende la SEQ ID NO: 4, y donde el fragmento tiene al menos un 80% de homología de secuencia con respecto a la SEQ ID NO: 4, más preferiblemente un 85%, más preferiblemente un 90%, más preferiblemente un 95%, más preferiblemente un 97%, más preferiblemente un 99% y lo más preferiblemente un 99, 9% de homología de secuencia con respecto a dicha SEQ ID NO: 4, donde un aumento del nivel del al menos un factor de transcripción que contiene homeodominio, o de un fragmento del mismo, que se observe en la muestra de ensayo es indicativo de que la enfermedad está en progreso o de que se ha iniciado.

2. Un método según la reivindicación 1, donde (A) el aumento es significativo estadísticamente, determinado usando un “test-t” que proporciona intervalos de confianza de preferiblemente al menos el 80%, más preferiblemente al menos el 85%, más preferiblemente al menos el 90%, más preferiblemente al menos el 95%, más preferiblemente al menos el 99%, más preferiblemente al menos el 99, 5%, más preferiblemente al menos el 99, 95%, y lo más preferiblemente al menos el 99, 99%. y/o (B) (i) un aumento entre el control y la muestra indicativo de cáncer de próstata en etapa temprana oscila aproximadamente entre 110 y 200%, y lo más preferiblemente está alrededor de 125%, o (ii) un aumento entre el control y una muestra indicativo de cáncer de próstata de etapa avanzada oscila aproximadamente entre 550 y 620%, más preferiblemente oscila aproximadamente entre 560 y 600%, más preferiblemente oscila aproximadamente entre 570 y 590%, y lo más preferiblemente está alrededor de 580%, o (iii) un aumento, relativo a una muestra o control de etapa temprana, que oscila aproximadamente entre 100 y 300%, y preferiblemente de aproximadamente 200%, es indicativo de progresión del cáncer desde una etapa temprana a una etapa avanzada.

3. Un método según la reivindicación 1 ó 2, para detectar el inicio, la progresión, la estabilización, el alivio y/o la remisión de cáncer de próstata o la eficacia de un tratamiento para cáncer de próstata, donde opcionalmente se proporcionan al menos dos etapas de detección y/o cuantificación, espaciadas temporalmente.

4. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la detección y/o la cuantificación del al menos un factor de transcripción que contiene homeodominio, o un fragmento del mismo, detectable en orina se realiza mediante uno o más del grupo que consiste en: MALDI-TOF, SELDI, por interacción con un ligando o ligandos, sistemas de análisis basados en gel 1D ó 2D, Cromatografía de Líquidos que combine cromatografía de líquidos y técnicas de espectrometría de masas, incluyendo ICAT® o iTRAQ®, cromatografía de capa fina, y espectroscopía de RMN.

5. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la detección y/o la cuantificación del al menos un factor de transcripción que contiene homeodominio, o de un fragmento del mismo, se realiza mediante uno o más del grupo que consiste en: inmunoensayos tipo sándwich, ensayos inmunosorbentes ligados a enzima (ELISAs) , radio-inmunoensayos (RAI) , inmunoensayos enzimáticos (EIA) , ensayos de transferencia Western, inmunoprecipitación, e inmunoensayos basados en partículas, que incluyen partículas de oro, plata ó látex, partículas magnéticas o puntos-Q, donde opcionalmente la detección y/o la cuantificación del al menos un factor de transcripción que contiene homeodominio, o de un fragmento del mismo, se lleva a cabo sobre una placa de microtitulación, en formato de tira, sistema o sobre un chip, donde opcionalmente la detección y/o la cuantificación del al menos un factor de transcripción que contiene homeodominio, o de un fragmento del mismo, se realiza mediante un ELISA que comprende anticuerpos específicos para el al menos un péptido EN-2, o un fragmento del mismo, preferiblemente unido a un indicador.

6. Un método según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la detección y/o la cuantificación del al menos un péptido de EN-2, o de un fragmento del mismo, se realiza mediante un biosensor.

7. Un uso in vitro del al menos un factor de transcripción que contiene homeodominio, o de un fragmento del mismo, como biomarcador para cáncer de próstata, donde el factor de transcripción que contiene homeodominio es un péptido de EN-2 que comprende la SEQ ID NO: 4, y donde el fragmento tiene al menos un 80% de homología de secuencia con respecto a la SEQ ID NO: 4, más preferiblemente un 85%, más preferiblemente un 90%, más preferiblemente un 95%, más preferiblemente un 97%, más preferiblemente un 99% y lo más preferiblemente un 99, 9% de homología de secuencia con respecto a dicha SEQ ID NO: 4, donde el uso comprende la detección de la cantidad del factor de transcripción que contiene homeodominio, o de un fragmento del mismo, en orina.

8. El uso según la reivindicación 7, donde dicho uso es en un método seleccionado del grupo que consiste en: escrutinio clínico, métodos de determinación de prognosis, monitorización de resultados de terapia, método de identificación de pacientes con mayor probabilidad de responder a un tratamiento terapéutico particular, y escrutinio y desarrollo de fármacos, donde opcionalmente dichos pacientes han sido diagnosticados previamente como negativos para cáncer usando un ensayo que detecta PSA.