Preparado líquido de dímero D estable.

Preparado constituido por una matriz tampón, que contiene dímero D,

caracterizado porque la matriz tampóncontiene fibrinógeno en una concentración final de 0,1 g/L a 1 g/L, de modo especialmente preferente de 0,2 a g/L a0,5 g/L.

Preparado líquido de dímero D estable La invención se sitúa en el campo del diagnóstico de coagulación, y se refiere a un preparado líquido constituido por una matriz tampón que contiene dímero D, que es apropiado como material standard con fines de control y calibrado.

Dímero D es un parámetro de laboratorio significativo para la identificación de la activación de coagulación. El objetivo de la coagulación de la sangre es la formación de un coágulo de sangre (trombo) , que debe mantener lo más reducida posible la pérdida de sangre mediante el cierre de la herida en caso de lesión. La transformación de fibrinógeno que se presenta en la sangre de forma ubicua en fibrina insoluble es un componente esencial de la formación del coágulo de sangre. El precursor de fibrina fibrinógeno es una glicoproteína dímera de gran molecularidad, que está constituida por tres pares de cadenas (cadenas a, ß y V) , que están unidas entre sí mediante puentes disulfuro. La formación de fibrina se efectúa mediante una secuencia de procesos enzimáticos, proteolíticos. En primer lugar, la trombina disocia el fibrinopéptido A de las regiones N-terminales de las cadenas a, y después el fibrinopéptido B de las cadenas º de fibrinógeno, mediante lo cual se produce la DesAABB-fibrina en forma de monómero. Estos monómeros de fibrina solubles polimerizan espontáneamente para dar fibras largas, y finalmente para dar un retículo denso ramificado, siendo aún soluble esta forma de fibrina. Esta fibrina, aún relativamente inestable, se estabiliza finalmente mediante la actividad del factor de coagulación sanguíneo XIIIa (F XIIIa) , reticulando en transversal F XIIIa en primer lugar las cadenas Y de fibrina para dar dímeros, y finalmente las cadenas a para dar polímeros. Como antagonista del sistema de coagulación sanguíneo actúa el sistema de fibrinólisis, cuya tarea es disolver de nuevo el coágulo de sangre y garantizar de este modo, por ejemplo, la recanalización del vaso sanguíneo. Durante la fibrinólisis se disocian mediante proteólisis tanto fibrinógeno, como también fibrina a través de plasmina, formándose diversos productos de disociación, ahora nuevamente hidrosolubles. Los productos de degradación de fibrinógeno y fibrina se diferencian. El mínimo producto de degradación específico de fibrina es el dímero D, que está constituido por dominios D unidos mediante enlace covalente mediante FXIIIa. Por lo tanto, el dímero D es apropiado como marcador de fibrinólisis, y constituye un parámetro diagnóstico significativo para la identificación de la activación de la coagulación. Por lo tanto, en el diagnóstico de la activación de la coagulación intravasal se emplean anticuerpos que identifican específicamente dímeros D. La determinación cuantitativa del antígeno del dímero D en muestras de plasma o suero aporta informaciones para la disgregación de trombosis venosa y embolia pulmonar, y se emplea para el diagnóstico de la coagulación intravasal diseminada.

En el estado de la técnica se conocen diversos procedimientos de ensayo para la identificación cuantitativa de dímero D en muestras de plasma o suero humanos. Los anticuerpos específicos del dímero D posibilitan tanto la aplicación de procedimientos químicos inmunológicos, como ensayo de aglutinación de látex, o de ensayo enzimático-inmunológico. En los diversos procedimientos de ensayo de dímero D es habitual emplear preparaciones que contienen dímero D de diferente concentración de antígeno de dímero D como controles o calibradores, conteniendo los controles para el intervalo de medida normal habitualmente menos de 0, 5 mg/L de dímero D FEU, y conteniendo los controles para el intervalo de medida patológico más de 0, 5 mg/L de dímero D FEU. FEU significa unidad equivalente de fibrinógeno, y es la unidad más común, utilizada mundialmente, para dímero D. 1 mg/L de dímero D corresponde en este caso a 2 mg/L de dímero D FEU, basándose la conversión en que a partir de una molécula de fibrinógeno se producen dos moléculas de dímero D, tras formación de fibrina y subsiguiente fibrinólisis.

Los controles o calibradores de dímero D para el control de calidad de ensayos de dímero D comerciales están constituidos habitualmente por una matriz de plasma, y se obtienen esencialmente a partir de plasma humano estabilizado, al que se añaden cantidades definidas de dímero D. Como es sabido, se puede obtener dímero D, por ejemplo, tratándose plasma humano con un activador de la coagulación, y finalmente con plasmina, mediante lo cual se desencadena en primer lugar la formación de fibrina, y a continuación la degradación de fibrina. Los dímeros D producidos en este plasma denominado de lisis de coágulo mediante la degradación de fibrina se pueden concentrar y purificar. Alternativamente, para la obtención de dímero D se puede polimerizar también fibrinógeno puro mediante adición de cloruro de calcio, F XIIIa y trombina para dar fibrina, que se degrada a continuación mediante incubación con plasmina.

La gran parte de estos controles o calibradores conocidos se liofiliza actualmente por motivos de estabilidad tras el envasado. No obstante, en principio también es posible obtener controles o calibradores de dímero D líquidos, no liofilizados, con suficiente estabilidad. Laboratorios Bio-Rad ofrece, por ejemplo, controles de dímero D líquidos a base de plasma humano (LiquichekTM D-Dimer Control, nivel 1, 2 y 3) , cuyos períodos de ejecución se especifican con tres años. Otro producto líquido que contiene dímero D, en el que el dímero D se presenta en una matriz tampón estabilizada, disponía de un período de ejecución de 18 meses. En este caso, la estabilización se efectuó a través de estabilizadores generales, inespecíficos, como albúmina de vaca y aprotinina como inhibidor de proteasas de serina, como trombina o plasmina. Dempfle describe una preparación standard para ensayos de dímero D, que presenta una concentración de fibrinógeno fisiológica (Dempfle, C. E-, D-dimer testing and venous thromboembolism: four view points. J Thromb Haemost 2005; 3: 377-9) . No obstante, no son conocidos

estabilizadores o procedimientos específicos para dímero D, que son especialmente apropiados para la estabilización del analito en matriz líquida.

Por consiguiente, la tarea que motiva la invención consistía en poner a disposición un preparado que contiene dímero D y que dispone de una estabilidad suficiente en estado líquido, es decir, que garantiza una recuperación constante del analito dímero D.

El problema se soluciona mediante la puesta a disposición de un preparado según la reivindicación 1.

Es objeto de la invención un preparado constituido por una matriz tampón, que contiene dímero D y adicionalmente fibrinógeno en una concentración final de 0, 1 g/L a 1 g/L, de modo especialmente preferente de 0, 2 a g/L a 0, 5 g/L. Se descubrió que mediante la adición de dímero D de fibrinógeno se obtienen preparados que garantizan una recuperación suficientemente constante de dímero D a una temperatura de almacenaje de 37ºC hasta 24 horas, mientras que los preparados de dímero D a los que no se añade fibrinógeno, a una temperatura de almacenaje de 37ºC ya después de 10 semanas, no posibilitan una recuperación aceptable de dímero D.

El preparado según la invención está constituido por una matriz tampón, y por ello se debe diferenciar de preparados que están constituidos esencialmente por una matriz de plasma. Los preparados basados en una matriz de plasma, que se emplean como calibradores o controles, están constituidos habitualmente por un plasma normal o deficiente, y por consiguiente contienen fibrinógeno endógeno. Un preparado según la invención basado en una matriz tampón está constituido esencialmente por una disolución tamponada, que no contiene fibrinógeno endógeno, y a la que se añade el analito dímero D, así como el fibrinógeno en forma purificada o parcialmente purificada. Para la obtención de la matriz tampón son apropiadas sobre todo substancias que presentan un efecto tamponante en el intervalo de pH de 5 a 10. Por ejemplo son apropiados tampón fosfato, tampón acetato, tampón citrato, tampón arginina, tampón histidina y TRIS-tampón. Es especialmente preferente una matriz tampón con un valor de pH de aproximadamente 6 a 9.

El preparado según la invención, constituido por una matriz tampón, contiene dímero D en la pureza y concentración deseadas. En el caso del dímero D contenido en el preparado se trata de dímero D procedente de plasma de lisis de coágulo o de un producto de degradación de fibrinógeno puro, preferentemente humano, que se polimerizó, a modo de ejemplo, mediante adición de cloruro de calcio, F XIIIa... [Seguir leyendo]

1. Preparado constituido por una matriz tampón, que contiene dímero D, caracterizado porque la matriz tampón contiene fibrinógeno en una concentración final de 0, 1 g/L a 1 g/L, de modo especialmente preferente de 0, 2 a g/L a 0, 5 g/L.

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2. Preparado según la reivindicación 1, caracterizado porque el fibrinógeno es fibrinógeno humano o animal.

3. Preparado según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el preparado es líquido.

4. Preparado según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la matriz tampón contiene aproximadamente 0, 1 a aproximadamente 100 mg/L de dímero D FEU.

5. Preparado según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque contiene adicionalmente una 10 proteína inerte, preferentemente albúmina de suero de vaca, y/o un inhibidor de proteasa, y/o un detergente, y/o un aditivo con acción bactericida y/o fungicida, preferentemente azida sódica.

6. Preparado según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la matriz tampón contiene un 0 a un máximo de un 10 por ciento en volumen de plasma de lisis de coágulo.

7. Preparado según la reivindicación 6, caracterizado porque la matriz tampón contiene un máximo de un 5 por 15 ciento en volumen, preferentemente un máximo de un 1 por ciento en volumen, de modo especialmente preferente un máximo de un 0, 5 por ciento en volumen de plasma de lisis de coágulo.

8. Empleo de un preparado que contiene dímero D según una de las reivindicaciones precedentes para el control o calibrado de procedimientos de ensayo para la determinación de dímero D.

9. Empleo según la reivindicación 8 para el control o calibrado de procedimientos de ensayo basados en 20 anticuerpos para la determinación de dímero D, en el que se emplea el anticuerpo dímero anti-D monoclonal 8D3.

10. Procedimiento para la obtención de un preparado según la reivindicación 1, que contiene dímero D, caracterizado porque se mezcla una disolución de dímero D con una disolución de fibrinógeno acuosa, tamponada.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque el preparado se incuba tras el mezclado durante un intervalo de tiempo limitado a 30 hasta 50ºC, preferentemente a 37ºC.

12. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque el preparado se incuba tras el mezclado durante 4 horas a 7 días, preferentemente durante 12 horas a 3 días, a 30 hasta 50ºC.

13. Empleo de fibrinógeno de origen humano o animal para la estabilización de un preparado, que está constituido por una matriz tampón que contiene dímero D.