Biocatalizador con actividad nucléosido desoxirribosiltransferasa inmovilizado sobre partículas magnéticas de quitosano.

Biocatalizador con actividad nucléosido desoxirribosiltransferasa inmovilizado sobre partículas magnéticas de quitosano.

La invención se refiere a un nuevo biocatalizador basado en la inmovilización covalente de la nucléosido 2'-desoxirribosiltransferasa de Lactobacillus reuteri en partículas magnéticas obtenidas a partir de quitosano y Fe3O4 (magnetita). Asimismo, la invención se refiere al procedimiento para elaborar dicho biocatalizador y al procedimiento para utilizarlo en la síntesis de distintos nucleósidos de interés terapéutico como ara-A, ara-C, 2'-fluoro-2'-desoxiadenosina y 2'-fluoro-2'-desoxicitidina.

Biocatalizador con. actividad nucléosido desoxirrihosiltransferasa inmovilizado sobre partículas magnéticas-de quitosano.

Sector de la técnica La presente invención se encuadra en el sector de la Biotecnología. Más concretamente, se refiere a la síntesis de nucleósidos naturales y no naturales con actividad terapéutica mediante métodos biotecnológicos. Dicha síntesis se puede realizar mediante la utilización de un nuevo biocatalizador enzimático, cuya preparación incluye la inmovilización covalente de la nucléosido 2'-desoxirribosiltransferasa en partículas magnéticas obtenidas a partir de quitosano y Fe304 (magnetita) .

Estado de la técnica Los nucleósidos modificados son moléculas de gran interés en la industria fannacéutica ya que presentan actividad antiviral y antitumoral, y pueden ser utilizados como sustratos de partida en la síntesis de oligonucleótidos antisentido [Robak T. et al., PurÍne nucleoside analogs as immunosuppressive and antineoplastic agents: mechanism of action and, c1inical activity. Curro Med. Chem. 13, 3165-3189, 2006; de Clercq E. Highlights in the discover y ofantiviral drugs: a personal retrospective. 1. Med. Chem. 53, 1438-1450, 2010]. Los efectos adversos de los análogos de nucleósidos disponibles en la actualidad, así como la aparición de resistencias debido a su utilización prolongada, ha suscitado el interés por el desarrollo de nuevos análogos de nude6sidos con propiedades terapéuticas mejoradas. Estos análogos tradicionalmente se han sintetizado mediante métodos químicos que suponen con frecuencia muchas etapas de protección y desprotección de grupos funcionales, tanto en la base como en el azúcar del nucleósido natural de partida. En este sentido, cualquier proceso enzimático de síntesis de dichos análogos de nudeósidos es una alternativa interesante al proceso químico descrito, ya que supondría una tecnología respetuosa con el medio ambiente, utilizando enzimas como biocatalizadores con una elevada enantioespecificidad y regioselectividad en condiciones muy suaves de reacción [Lewkowicz E.S., ¡ribarren A.M., Nuc1eoside phosphor y lases. Curro Drg. Chem. lO, 11971215, 2006; Li N. el al., Biocatalytic transfonnation of nucleoside derivatives. Biotechnol. Adv. 28, 348-366, 2010; Mikhailopulo LA. Biotechnology of nucleic acid constituents: state of the art and perspectives. Curro Org. Chem. 11, 317-333, 2007]. Para la síntesis enzimática de nucleósidos se pueden utilizar nucleósido fosforilasas o nucJeósido desoxirribosiltransferasas, enzimas procedentes de microorganismos que catalizan la reacción de transferencia de residuos glicosilados a bases nitrogenadas aceptoras. A diferencia de las nucleósido fosforilasas, las nucleósido desoxirribosiltransferasas (EC 2.4.2.6) presentan corno ventaja su capacidad de catalizar, en el mismo proceso enzimático, la ruptura del enlace glucosídico de un desoxirribonucleósido y la posterior transferencia del resto glicosilado a una hase púrica o pirimidínica que actúa como aceptor. Dicha reacción enzimática es regioselectiva (ya que la transferencia ocurre en la posición N-l de la base pirimidínica o en la posición N-9 de la base púrica) y enantioselectiva (ya que s610 se sintetizan los anómeros con conformación P) . A diferencia de las purina desoxirribosiltransferasas (PDTs) que catalizan exclusivamente la transferencia de la 2'desoxirribosa entre bases púricas, las nucleósido 2'-desoxirribosiltransferasas (NDTs) son capaces de catalizar dicha transferencia entre bases púricas y/o pirimidínicas [Kaminsiki P.A. Functional cloning, heterologous expression, and purification of two different Ndeoxyribosyltransferases from Laclobacillus helveticus. J. BioL Chem. 277, 14400-14407, 2002]. Desde un punto de vista industrial, las transglicosilaciones en un solo paso catalizadas por las NDTs son más ventajosas que las basadas en la utilización de fosforilasas microbianas ya que, estas últimas, requieren la participación de una purina nucleósido fosforilasa y una pirimidina nucleósido fosforilasa [Lewkowicz E.S., lribarren A.M., Nucleoside phosphor y lases. Curro Org. Chem. 10, 1197-1215, 2006]. Las principales NDTs bacterianas descritas para estos procesos proceden de Lactobaeillus fermentum , Lactobaeillus leichmanni¡ [Kaminsiki P.A. el al., In vivo reshaping the catalytic site of nucleoside 2'-deoxyribosyltransferase for dideoxy-and didehydronucleosides via a single amino acid substitution J. Biol. Chem. 283, 20053-20059, 20081, Laelobaeillus helvelieus [Kaminsiki P.A. Functional cloning, heterologous expression, and purification of two different N-deoxyribosyltransferases from Lactobacillus helvetieus. 1. BioL Chem. 277, 14400-14407, 2002], Laclobacillus reuleri [Femández-Lucas J. el al., Laclobacillus reuleri 2'-deoxyribosyltransferase, a novel biocatalyst for tailoring of nucleosides. AppL Environ. Microbio!. 76, 1462-1470, 201OJ, Y Laelocoeeus laetis subsp. laelis [Miyamoto el al., Characterization of N-deoxyribosyltransferase from Laelococeus lactis subsp. laclis. Biochim. Biophys. Acta 1774, 1323-1330, 2007].

La clonación e hiperexpresión del gen ndl que codifica la nucléosido 2'desoxirribosiltransferasa de Laclobaeillus reuleri ha pennitido la caracterización funcional

y estructural de la enzima ~soluble, así como poner de manifiesto su potencial como biocatalizador en la síntesis de diferentes nucleósidos naturales y no naturales de interés terapéutico. Además, esta nucléosido 2'-desoxirribosiltransferasa presenta una actividad inesperada para este tipo de enzimas, que consiste en su capacidad para sintetizar arabinonucleósidos, capacidad que no comparte con las otras enzimas nucléosido 2'desoxirribosiltransferasa conocidas [Femández-Lucas J. el al., Lactobacillus reuleri 2'deoxyribosyltransferase, a novel biocatalyst foc tailoring of nucleosides. Appl. Environ. Microbiol. 76, 1462-1470, 2010]. Sin embargo, la inmovilización de la NDT de L. reuteri es un requisito previo fundamental para que un posible proceso industrial de síntesis enzimática de nucleósidos sea factible económicamente ya que permitiría su reutilización en múltiples ciclos así como su estabilización en un amplio rango de condiciones experimentales. En la literatura científica sólo aparecen descritos dos biocatalizadores inmovilizados a partir de nucléosido 2'-desoxirribosiltransferasas. El primero está preparado a partir de la enzima nativa y semipurificada de Lactobacillus leichmannii irunovilizada sobre un copolímero sintético [Hicks N., Hutchinson D.W. Synthesis of nucleoside analogs using immobilized N-deoxyribosyltransferases. Biocatalysis 11, 1-7, 1994] y, como ya se ha comentado, no presenta actividad arabinosiltransferasa, mientras que el segundo está preparado con la enzima recombinante pura de 1. reuteri unida covalentemente al soporte comercial Sepabeads® [Femández-Lucas J, el al., Enzymatic synthesis of nucleoside analogues using immobilized 2'-deoxyribosyltransferase from Laclobacillus reuleri. App!. Microbio!. Biotechno!. 91, 317-327, 2011]. En este segundo caso, al ser inmovilizada, la enzima pierde su capacidad para sintetizar arabinosilnucleósidos, y los autores del trabajo especulan sobre la posibilidad de que esa pérdida de actividad se deba a la unión de tipo covalente que tiene lugar para la inmovilización.

Explicación de la invención La presente invención se refiere a un biocatalizador que comprende la enzima nucléosido 2'-desoxirribosiltransferasa inmovilizada en un soporte biodegradable que incluye partículas magnéticas obtenidas a partir de quitosano y Fe) 04 (magnetita) . En la inmovilización de enzimas, los soportes biodegradables presentan la ventaja de ser menos contaminantes que los soportes sintéticos. Esta característica, unida al hecho de que la reacción catalizada por la enzima inmovilizada transcurre en condiciones suaves y en medio acuoso de reacción, permite la obtención de nucle6sidos de interés terapéutico a través de un proceso biosostenible. En una realización de la invención la enzima es de origen procariota Y. preferentemente, es la nucle6sido Z'-desoxirribosiltransferasa de Lactobaci//us reuteri (LrNDT) , caracterizada por SEQ ID NO: 2. La invención también incluye biocatalizadores que tienen inmovilizados polipéptidos con, al menos, un 80% de identidad con SEQ ID NO: 2 y que conservan la actividad nucleósido 2'desoxirribosiltransferasa. Se entiende por "porcentaje de identidad" de la secuencia aminoacídica el porcentaje de coincidencias de los mismos aminoácidos entre dos secuencias alineadas, a lo largo de la longitud completa de ambas secuencias.

La enzima nucleósido 2'-desoxirribosiltransferasa se puede obtener recombinante mediante la expresión del gen ndt de L. reuteri, caracterizado por SEQ ID NO: 1, en una bacteria fácilmente manipulable... [Seguir leyendo]

l. Biocatalizador inmovilizado que comprende la enzIma nucleósido 2' -desoxirribosil

transferasa inmovilizada covalentemente en partículas sólidas elaboradas a partir de 5 magnetita (Fe304) atrapada en quitosano.

2. Biocatalizador inmovilizado segun la reivindicación 1 en el que las partículas sólidas elaboradas a partir de magnetita (Fe304) atrapada en quitosano están activadas con glutaraldehído.

3. Biocatalizador inmovilizado según cualquiera de las reivindicaciones 1-2 en que la nucle6sid.

2. desoxirribosil-transferasa es de origen procariota.

4. Biocatalizador inmovilizado según la reivindicación 3 en que la enzima inmovilizada es

la nucleósid.

2. desoxirribosil-transferasa de Lactobacillus reuteri, caracterizada por SEQ ID NO: 2, o un polipéptido cuya secuencia üene, al menos, un 80% de identidad con SEQ ID NO: 2 y conserva su actividad nucleósid.

2. desoxirribosil-transferasa.

5. Biocatalizador inmovilizado según la reivindicación 4 en que la nucleósido 2'20 desoxirribosil-transferasa es una enzima recombinante.

6. Biocatalizador inmovilizado según la reivindicación 5 en que la nucleósido 2'desoxirribosil-transferasa recombinante procede de la expresión del gen ndt de L. reuteri, caracterizado por SEQ ID NO: 1, o de una secuencia con, al menos, un 70% de identidad

2S con SEQ ID NO: 1, recombinante en Escherichia coli.

7. Procedimiento para la preparación del biocatalizador inmovilizado definido en las reivindicaciones anteriores que comprende: (a) el atrapamiento de magnetita en una matriz polimérica de quitosano, (b) el entrecruzamiento de las cadenas poliméricas de quitosano,

(c) la activación de las partículas magnéticas, (d) la unión de la enzima nucleósido 2'desoxirribosil-transferasa a las partículas magnéticas obtenidas en el paso (c) .

8. Procedimiento según la reivindicación 7 en el que el paso (a) incluye la preparación de una solución de quitosano al 3% en ácido acético en la que se dispersa homogéneamente u.

2. 50% de magnetita, con respecto a la cantidad de quitosano; la adición de la suspensión resultante a una solución de NaOH mediante goteo; y la agitación de las partículas obtenidas durante 0, 5-3 horas en la solución de NaOH.

9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7-8 en que el paso (b) se realiza con epicIorhidrina al 2-5% a SO°e.

10. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7-9 en el que el paso (e) incluye la incubación de las partículas magnéticas en una solución tamponada de glutaraldehído a 25°C.

11. Procedimiento según la reivindicación lOen que la concentración de glutaraldehído en solución tamponada es del 2, 5%.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 7-11 en el que el paso (d) incluye poner en contacto 11-70 J.l.g de nucleósid.

2. desoxirribosil-transferasa purificada con 17-50 mg de las partículas magnéticas del paso (e) .

13. Procedimiento según la reivindicación 12 en el que la nucleósid.

2. desoxirribosiltransferasa se pone en contacto con las partículas magnéticas del paso (e) a pH 7 Y durante 2-5 horas a 25'C.

14. Procedimiento para la producción de nucleósidos naturales y no naturales mediante una reacción enzimática de transglicosilación en un solo paso, entre un nucleósido donador de residuos glicosilados (que contiene una base púrica y/o pirimidínica) y una base nitrogenada aceptora de residuos glicosilados, que comprende el uso del biocatalizador definido en las reivindicaciones 1-6.

15. Procedimiento según la reivindicación 14 en que el residuo glicosilado del nucleósido donador es p-D-arabinosa.

2. desoxi-p-D-ribosa .

2. fluoro-2' -desoxi-p-D-ribosa, y la base aceptora es citosina o adenina.

16. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14-15 en que la reacción se realiza a 40°C.

17. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14-16 en que la reacción se realiza a pH 6, 5.

18. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14-17 en que, tras la conclusión de la reacción, el biocatalizador inmovilizado se separa de la mezcla de reacción mediante aplicación de un campo magnético, filtración, decantación o centrifugación, y es reutilizable en reacciones de transglicosilación sucesivas.

19. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 14-18 en que el nucleósido producido está incluido en el siguiente grupo.

2. desoxiadenosina; arabinosil-nude6sidos como el arabinósido de adenina (ara-A) y el arabinósido de citosina (ara-e) .

2. fluoro-2'desoxiribonucleósidos como l.

2. fluoro-2' -desoxiadenosina y l.

2. fluoro-2'desoxicitidina.