Anticuerpos y proteínas humanas.

Un método para escrutar una región variable de un anticuerpo compuesto o de un fragmento que se une a antígeno para evitar epítopos de linfocitos T,

en donde el método comprende las siguientes etapas:

generar una genoteca que codifica regiones variables de anticuerpos compuestos o fragmentos que se unen a antígeno obtenidos a partir de múltiples péptidos con una secuencia de aminoácidos de 2 a 31 aminoácidos de longitud, procedentes de otros anticuerpos o fragmentos que se unen a antígeno, en donde los dos o varios péptidos no son ni CDRs completas ni regiones estructurales completas;

escrutar la región variable del anticuerpo o de un fragmento que se une a antígeno para evitar epítopos de linfocitos T; y

expresar y escrutar la genoteca de regiones variables de anticuerpos o fragmentos que se unen a antígeno con miras a la unión a uno o a varios antígenos de interés.

Anticuerpos y proteínas humanas.

La presente invención se refiere a métodos para escrutar regiones variables de anticuerpos compuestos o fragmentos que se unen a antígeno, para evitar epítopos de linfocitos T cooperadores. Los métodos comprenden escrutar genotecas que codifican regiones variables de anticuerpos compuestos. Tales métodos permiten la generación de anticuerpos y proteínas para uso como agentes farmacéuticos en humanos o como agentes de diagnóstico in vivo.

En los últimos 20 años se han visto grandes avances en la generación de anticuerpos monoclonales recombinantes para uso como potenciales agentes farmacéuticos en el hombre. Las técnicas de quimerización, humanización y 10 clonación de anticuerpos humanos, ya sea por la presentación en fagos o en ratones transgénicos, han proporcionado anticuerpos que generalmente se toleran bien cuando se administran al hombre, con menos inmunogenicidad que con anticuerpos monoclonales no humanos. Sin embargo, se ha demostrado que diversos anticuerpos generados por estas técnicas inducen inmunogenicidad en pacientes, incluso cuando los orígenes genéticos de tales anticuerpos son humanos. Por ejemplo, el anticuerpo humano Humira® provoca inmunogenicidad 15 en el 12% de los pacientes con artritis reumatoide y el anticuerpo humanizado CAMPATH® provoca inmunogenicidad en aproximadamente el 50% de los pacientes. Tal inducción de la inmunogenicidad es debida probablemente a la presencia, dentro de la región variable del anticuerpo, de tramos de secuencias de aminoácidos que no son propios que en algunos casos, pueden crear epítopos de linfocitos T que inducen respuestas de linfocitos T que dan como resultado una inmunogenicidad. Por lo tanto, existe una necesidad de mejorar las técnicas y las composiciones de anticuerpos que tienen un origen humano elevado, pero que evitan, tanto como sea posible, la creación de secuencias que puedan inducir respuestas de linfocitos T.

La presente invención proporciona un escrutinio mediante el cual se escrutan regiones variables de anticuerpos compuestos o fragmentos de las mismas que se unen a antígeno, que combinan dos o más péptidos de una secuencia de aminoácidos de 2 a 31 aminoácidos de longitud.

Por lo tanto, en un primer aspecto, la presente invención proporciona un método para escrutar una región variable de un anticuerpo compuesto o un fragmento que se une a antígeno para evitar epítopos de linfocitos T cooperadores, en donde el método comprende las siguientes etapas:

generar una genoteca que codifica regiones variables de anticuerpos compuestos o fragmentos que se unen a antígeno obtenidos a partir de múltiples péptidos con una secuencia de aminoácidos de 2 a 31

aminoácidos de longitud, procedentes de otros anticuerpos o fragmentos que se unen a antígeno, en donde los dos o varios péptidos no son ni CDRs completas ni regiones estructurales completas;

escrutar la región variable del anticuerpo o de un fragmento que se une a antígeno para evitar epítopos de linfocitos T cooperadores; y

expresar y escrutar la genoteca de regiones variables de anticuerpos o fragmentos que se unen a antígeno 35 para determinar la unión a uno o a varios antígenos de interés.

En el contexto de la presente invención, los péptidos son una secuencia de aminoácidos contiguos que se encuentra dentro de una molécula de anticuerpo, teniendo tales péptidos una longitud de 2 a 31 aminoácidos en donde tales péptidos no son ni CDRs completas ni regiones estructurales completas. Para uso terapéutico, las regiones variables de anticuerpos compuestos típicamente combinarán dos o varios péptidos de una secuencia de aminoácidos 40 procedente de diferentes anticuerpos humanos, dentro de las regiones variables compuestas. En particular, las regiones variables de las cadenas pesada y ligera de anticuerpos compuestos (VH y VL, respectivamente) , en donde cada VH y VL se compone enteramente de segmentos de secuencias procedentes de dos o varias regiones variables de anticuerpos humanos y en donde típicamente cada VH y VL compuesta incluye segmentos de posiciones de la secuencia de la región variable humana, correspondientes a sus posiciones en las VHs y VLs de los 45 anticuerpos humanos originarios, por ejemplo, los aminoácidos 1 a 10 en la secuencia de VH compuesta se habrán obtenido a partir de los aminoácidos 1 a 10 de un anticuerpo humano. Como alternativa, los segmentos de la secuencia VH o VL humana en la región variable del anticuerpo compuesto pueden estar situados en cualquier posición de la secuencia, independientemente de la posición de la secuencia en la VH o VL del anticuerpo humano originario. Las VHs y VLs del anticuerpo humano originario pueden ser cualquier secuencia de aminoácidos de la 50 región variable de un anticuerpo humano existente, por ejemplo, como las que se proporcionan en bases de datos de secuencias de regiones variables de anticuerpos monoclonales humanos, y pueden incluir secuencias procedentes de anticuerpos madurados por afinidad con mutaciones somáticas en la región variable y otras variaciones que difieren de la línea germinal, secuencias procedentes de regiones variables de la línea germinal, secuencias procedentes de regiones variables de anticuerpos construidos de forma artificial, creadas a partir de 55 segmentos de una secuencia procedente de anticuerpos de tipos tales como anticuerpos con un conjunto de estructuras fijas de la región variable pero con CDRs variables, secuencias seleccionadas a partir de genotecas de anticuerpos humanos, tales como genotecas de presentación en fagos, y secuencias de anticuerpos humanos obtenidos a partir de animales transgénicos que expresan genes que codifican anticuerpos humanos o fragmentos de anticuerpo.

Los epítopos de linfocitos T humanos en el contexto de la presente invención son secuencias de aminoácidos que pueden unirse a moléculas del CMH de clase II humano y, a través de la presentación a linfocitos T CD4+, inducir una respuesta de los linfocitos T cooperadores. Los segmentos de la secuencia VH y VL humana y las 5 combinaciones de los segmentos se pueden elegir para limitar o evitar epítopos de linfocitos T en la región variable final del anticuerpo compuesto. Esto se puede lograr mediante el uso de segmentos que no contienen epítopos de linfocitos T, tales como los procedentes de secuencias de la línea germinal humana, y mediante la unión de segmentos adyacentes para crear una nueva secuencia que no contiene epítopos de linfocitos T, por ejemplo, mediante la creación de una secuencia que no se une al CMH en la unión de dos segmentos, mediante la creación de otra secuencia de la línea germinal humana, o mediante la creación de una secuencia que no induce una respuesta de linfocitos T cooperadores, a pesar de ser una secuencia que no es de la línea germinal.

Como se ha descrito en este documento, la presente invención proporciona métodos para escrutar regiones variables de anticuerpos compuestos. Típicamente, tales métodos comprenden las etapas siguientes:

(1) preparar genes de la región variable de anticuerpos, combinando segmentos de una secuencia de aminoácidos procedentes de una gama de otras regiones variables de anticuerpos, con el fin de generar una genoteca de genes diferentes de regiones variables

(2) clonar la genoteca de genes de la región variable de anticuerpos en un vector de expresión

(3) escrutar la genoteca de regiones variables de anticuerpos y recuperar los miembros de la genoteca con propiedades deseables.

En un primer método preferido "A" de la presente invención, se genera una genoteca de regiones de anticuerpos humanos compuestos y se escruta en busca de anticuerpos con propiedades deseables, tales como la unión a un antígeno específico. Este método implica 6 etapas del modo siguiente:

(1) diseño de genes VH y VL compuestos

(2) clonación de los genes VH y VL compuestos

(3) expresión de los genes VH y VL compuestos

(4) escrutinio y selección de los anticuerpos compuestos con propiedades deseables

(5) optimización de los anticuerpos compuestos guías

(6) evitación de los epítopos de linfocitos T

Para la etapa (1) , la genoteca de secuencias de VH y VL compuestas se diseña seleccionando segmentos de la secuencia de VH y VL procedentes de secuencias conocidas de la región V humana, tales como las disponibles en la base de datos de anticuerpos Kabat (www.bioinf.org.uk/abs/simkab.html) , la base de datos del NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov) y a partir de bases de datos de proteínas, tales como UniProt (www.ebi.uniprot.org) y PRF/SEQDB (www.prf.or.jp) . Además, se pueden complementar mediante la recolección de secuencias VH y VL humanas y mediante... [Seguir leyendo]

1. Un método para escrutar una región variable de un anticuerpo compuesto o de un fragmento que se une a antígeno para evitar epítopos de linfocitos T, en donde el método comprende las siguientes etapas:

generar una genoteca que codifica regiones variables de anticuerpos compuestos o fragmentos que se unen a antígeno obtenidos a partir de múltiples péptidos con una secuencia de aminoácidos de 2 a 31 aminoácidos de longitud, procedentes de otros anticuerpos o fragmentos que se unen a antígeno, en donde los dos o varios péptidos no son ni CDRs completas ni regiones estructurales completas;

escrutar la región variable del anticuerpo o de un fragmento que se une a antígeno para evitar epítopos de linfocitos T; y

expresar y escrutar la genoteca de regiones variables de anticuerpos o fragmentos que se unen a antígeno con miras a la unión a uno o a varios antígenos de interés.

2. Un método según la reivindicación 1, en donde los dos o varios péptidos empleados para generar la genoteca se obtienen a partir de anticuerpos humanos.