Anticuerpos quiméricos humano-murinos frente al virus respiratorio sincitial.

Un anticuerpo humanizado que neutraliza el RSV y que tiene:

una CDR de cadena pesada 1,

2 y 3 de MEDI-493 de la Figura 7 y una CDR de cadena ligera 1,2 y 3 de MEDI-493de la Figura 8, y una secuencia de estructura de cadena ligera humana con una homología de al menos un 82% conla región de estructura de cadena ligera del anticuerpo monoclonal murino 1129 de la Figura 8 y una secuencia deestructura de cadena pesada humana con una homología de al menos un 80% con la región de estructura decadena pesada del anticuerpo monoclonal murino 1129 de la Figura 7.

Anticuerpos quiméricos humano-murinos frente al virus respiratorio sincitial

Antecedentes El virus respiratorio sincitial (RSV) es la principal causa de la enfermedad respiratoria aguda en niños pequeños admitidos en hospitales, y la práctica de la comunidad tratará quizá cinco veces el número de niños hospitalizados. Por consiguiente, ésta es la causa más común de infección del tubo respiratorio inferior en niños pequeños. Aunque la mayoría de las infecciones del RSV adquiridas de la comunidad se resuelven por ellas mismas en un periodo comprendido entre una semana y diez días, muchos niños hospitalizados, especialmente de menos de seis meses de edad requieren ventilación asistida.

Los esfuerzos para producir una vacuna efectiva no han tenido éxito (8) . Un obstáculo principal para el desarrollo de una vacuna es la seguridad; la vacuna de RSV inactivada de formalina inicial causó un incremento de la incidencia de enfermedad del tubo respiratorio inferior de RSV y muerte en niños inmunizados expuestos al virus (5) .

Recientemente, se ha licenciado el fármaco ribavirina para la terapia de neumonía y bronquiolitis de RSV (2, 3) ; su valor es contradictorio (4) . Aunque la ribavirina ha mostrado eficacia (9) , el fármaco debe ser administrado durante un periodo de 18 horas por inhalación de aerosol. Además, el nivel de infecciones secundarias después del cese del tratamiento es significativamente mayor que en los pacientes no tratados.

Los estudios han demostrado que la inmunoglobulina del RSV de valoración alta fue efectiva tanto en la profilaxis como en la terapia de las infecciones del RSV en modelos animales (6, 7) . Los animales infectados tratados con inmunoglobulina del RSV, no mostraron evidencia de enfermedad pulmonar de inmunocomplejo (6, 7) .

Incluso si la globulina hiperinmunitaria del RSV muestra que reduce la incidencia y la severidad de la infección en el tubo respiratorio inferior del RSV en niños de alto riesgo, varias desventajas pueden limitar su uso. Un inconveniente es la necesidad de infusión intravenosa en estos niños que tienen un acceso venoso limitado debido a la anterior terapia intensiva. Una segunda desventaja es el gran volumen de RSVIG requerido para la protección, de forma particular debido a que la mayoría de estos niños tienen la función cardiopulmonar comprometida. Una tercera desventaja es que la infusión intravenosa precisa visitas mensuales al hospital durante la etapa del RSV lo que sitúa a estos niños en riesgo de infección de RSV nosocomial (1) . Un problema final es que puede probarse que es muy difícil seleccionar suficientes donantes para producir una globulina hiperinmunitaria para el RSV de modo que se pueda cumplir con la demanda de este producto. Actualmente, sólo aproximadamente el 8% de los donantes normales tienen valoraciones de anticuerpos que neutralizan el RSV lo suficientemente altos como para beneficiarse de la producción de globulina hiperinmunitaria.

Otra aproximación puede ser el desarrollo de anticuerpos monoclonales con una actividad neutralizante específica elevada como una alternativa a la globulina hiperinmunitaria. Es preferible, si no necesario, el uso de anticuerpos monoclonales mejor que anticuerpos murinos o de rata para minimizar el desarrollo de respuestas de anticuerpos anti-roedores humanos que puedan comprometer la eficacia terapéutica del anticuerpo o inducir patología de inmunocomplejo. Sin embargo, la generación de anticuerpos monoclonales humanos con la especificidad deseada puede ser difícil y el nivel de producción a partir de líneas celulares humanas es a menudo bajo, descartando su 45 desarrollo.

Una aproximación alternativa implica la producción de anticuerpos quiméricos de humano-ratón en los que la información genética que codifica las regiones variables de cadena pesada y ligera de murino está fijada a los genes que codifican las regiones constantes de pesada y ligera. El híbrido de ratón-humano resultante tiene aproximadamente un 30% de la inmunoglobulina intacta derivada de las secuencias de murino. Por consiguiente, aunque varios laboratorios han construido anticuerpos quiméricos con dominios variables de ratón y constantes de humano (10-18) , la región variable de ratón todavía es observada como extraña (19) . El documento WO9417105 divulga la humanización del mAb anti-RSV neutralizante murino designado como 1308F la unión al sitio antigénico C de la proteína F.

Sumario de la invención La presente invención proporciona el anticuerpo humanizado de las reivindicaciones 1-8, la composición farmacéutica de las reivindicaciones 9-18 y los usos de las reivindicaciones 19-32.

El término “animal” tal como se utiliza en la presente memoria se usa en su sentido más amplio incluyendo mamíferos que incluyen humanos.

Descripción detallada de los dibujos 65 Los dibujos representados y descritos en la presente memoria pretenden ilustrar de forma adicional la presente invención y no pretenden limitar la invención de ninguna manera.

La Figura 1 muestra el diseño de la secuencia de aminoácidos (AA) del glucoproteína VH de la glucoproteína anti-RSV F CDR-Injertada. La figura representa la secuencia de AA para el VH del HV3 humano antes del injerto, el VH

injertado de CDR, y el VH de murino MAb1308F a partir del que se injertó la secuencia de CDR. Las regiones intensamente subrayadas identifican la secuencia de CDR que fue injertada en el VH de HV3 humano y cada una de las tres regiones es identificada como CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente.

La Figura 2 muestra el diseño de la secuencia de aminoácidos (AA) del VL de la proteína anti-RSV F CDR-Injertada. La figura representa la secuencia de AA para el VL de K102 humano antes del injerto, el VL injertado de CDR, y el VL de MAb1308F a partir del que se injertó la secuencia de CDR. Estas regiones fuertemente subrayadas identifican la secuencia de CDR que ha sido injertada en el VL de K102 humano y cada una de las tres regiones es identificada como CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente.

La Figura 3 representa los oligonucleótidos utilizados para preparar el Hu1308VH, siendo las secuencias que están subrayadas las secuencias específicas del cebador.

La Figura 4 representa los oligonucleótidos utilizados para preparar el Hu1308VL, siendo las secuencias que están subrayadas las secuencias específicas del cebador.

La Figura 5 representa la construcción del plásmido de los vectores de expresión para el Humanizado 1308.

La Figura 6 representa un gráfico de la Neutralización del RSV como porcentaje de la neutralización frente a ng de MAb por reacción para la neutralización con Cos Hu1308F y con Mu1308F.

La Figura 7 muestra el diseño de la secuencia de aminoácidos (AA) del VH de la glucoproteína anti-RSV F CDR-Injertada. La figura representa la secuencia de AA para el COR VH humano antes del injerto, el VH CDR injertado, y el Mab1129 VH de murino a partir del que se ha injertado la secuencia de CDR. Las regiones subrayadas de forma intensa identifican la secuencia de CDR que ha sido injertada en el COR VH humano y cada una de las tres regiones es identificada como CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente.

La Figura 8 muestra el diseño de la secuencia de aminoácidos (AA) del VL de la proteína anti-RSV F CDR-injertada. La figura representa la secuencia de AA para el K102 VL humano antes del injerto, el VL CDR injertado, y el MAb1129 VL de murino a partir del que se injertó la secuencia de CDR. Las regiones subrayadas de modo intenso identifican la secuencia de CDR que ha sido injertada en el K102 VL humano y cada una de las tres regiones es identificada como CDR1, CDR2 y CDR3, respectivamente.

La Figura 9 muestra los oligonucleótidos utilizados para construir el 1129 VH humanizado.

La Figura 10 muestra los datos de unión para al 1129 humanizado en un ensayo ELISA.

Descripción detallada de la invención El trasplante en un anticuerpo de humano, de sólo la información genética para al menos una CDR a partir de cada 45 una de las cadenas pesada variable y ligera variable derivadas del anticuerpo monoclonal de murino frente al antígeno de RSV, es efectivo para la prevención y el tratamiento del RSV en animales. El anticuerpo de murino puede ser un anticuerpo neutralizante frente a RSV. El anticuerpo de murino puede ser un anticuerpo frente al antígeno de RSV F. El anticuerpo de murino puede ser un anticuerpo neutralizante frente al antígeno de RSV F. La sustitución de las CDR de ratón en los segmentos de estructura variable de humano minimiza el potencial para las respuestas de anticuerpos anti-ratón humanos (HAMA) mientras que retiene la afinidad de unión y la especificidad por el antígeno, la proteína... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo humanizado que neutraliza el RSV y que tiene:

una CDR de cadena pesada 1, 2 y 3 de MEDI-493 de la Figura 7 y una CDR de cadena ligera 1, 2 y 3 de MEDI-493 de la Figura 8, y una secuencia de estructura de cadena ligera humana con una homología de al menos un 82% con la región de estructura de cadena ligera del anticuerpo monoclonal murino 1129 de la Figura 8 y una secuencia de estructura de cadena pesada humana con una homología de al menos un 80% con la región de estructura de cadena pesada del anticuerpo monoclonal murino 1129 de la Figura 7.

2. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 1, en el que la estructura de cadena pesada del anticuerpo humanizado comprende la estructura de cadena pesada de MEDI-493 de la Figura 7.

3. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 1, en el que la estructura de cadena ligera del anticuerpo 15 humanizado comprende la estructura de cadena ligera de MEDI-493 de la Figura 8.

4. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 1, en el que la estructura de cadena ligera del anticuerpo humanizado comprende la estructura de cadena ligera de MEDI-493 de la Figura 8 y la estructura de cadena pesada del anticuerpo humanizado comprende la estructura de cadena pesada de MEDI-493 de la Figura 7.

5. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 1, en el que la cadena pesada del anticuerpo humanizado comprende el polipéptido de MEDI-493 de la Figura 7.

6. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 1, en el que la cadena ligera del anticuerpo humanizado comprende 25 el polipéptido de MEDI-493 de la Figura 8.

7. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 1, en el que la cadena pesada del anticuerpo humanizado comprende el polipéptido de MEDI-493 de la Figura 7 y la cadena ligera del anticuerpo humanizado comprende el polipéptido de MEDI-493 de la Figura 8.

8. El anticuerpo humanizado de la reivindicación 1, en el que la cadena ligera del anticuerpo humanizado comprende las CDR de cadena ligera de MEDI-493 de la Figura 8 y la cadena pesada del anticuerpo humanizado comprende las CDR de cadena pesada de MEDI-493 de la Figura 7.

9. Una composición farmacéutica que comprende:

(a) el anticuerpo humanizado de la reivindicación 1 y

(b) un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, en la que la estructura de cadena pesada del anticuerpo humanizado comprende la estructura de cadena pesada de MEDI-493 de la Figura 7.

11. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, en la que la estructura de cadena ligera del anticuerpo 45 humanizado comprende la estructura de cadena ligera de MEDI-493 de la Figura 8.

12. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, en la que la estructura de cadena ligera del anticuerpo humanizado comprende la estructura de cadena ligera de MEDI-493 de la Figura 8 y la estructura de cadena pesada del anticuerpo humanizado comprende la estructura de cadena pesada de MEDI-493 de la Figura 7.

13. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, en la que la cadena pesada del anticuerpo humanizado comprende el polipéptido de MEDI-493 de la Figura 7.

14. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, en la que la cadena ligera del anticuerpo humanizado 55 comprende el polipéptido de MEDI-493 de la Figura 8.

15. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, en la que la cadena pesada del anticuerpo humanizado comprende el polipéptido de cadena pesada de MEDI-493 de la Figura 7 y la cadena ligera del anticuerpo humanizado comprende el polipéptido de cadena ligera de MEDI-493 de la Figura 8.

16. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, en la que la cadena pesada del anticuerpo humanizado comprende las CDR de cadena pesada de MEDI-493 de la Figura 7 y la cadena ligera del anticuerpo humanizado comprende las CDR de cadena ligera de MEDI-493 de la Figura 8.

17. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, en la que la cadena pesada del anticuerpo humanizado comprende las CDR de cadena pesada de MEDI-493 de la Figura 7.

18. La composición farmacéutica de la reivindicación 9, en la que la cadena ligera del anticuerpo humanizado comprende las CDR de cadena ligera de MEDI-493 de la Figura 8.

19. El uso del anticuerpo humanizado de la reivindicación 1 para la preparación de una composición para prevenir la infección producida por el virus respiratorio sincitial en un ser humano.

20. El uso de la reivindicación 19, en el que la estructura de cadena pesada del anticuerpo humanizado comprende la estructura de cadena pesada de MEDI-493 de la Figura 7. 10

21. El uso de la reivindicación 19, en el que la estructura de cadena ligera del anticuerpo humanizado comprende la estructura de cadena ligera de MEDI-493 de la Figura 8.

22. El uso de la reivindicación 19, en el que la estructura de cadena ligera del anticuerpo humanizado comprende la

estructura de cadena ligera de MEDI-493 de la Figura 8 y la estructura de cadena pesada del anticuerpo humanizado comprende la estructura de cadena pesada de MEDI-493 de la Figura 7.

23. El uso de la reivindicación 19, en el que la cadena pesada del anticuerpo humanizado comprende el polipéptido de MEDI-493 de la Figura 7. 20

24. El uso de la reivindicación 19, en el que la cadena ligera del anticuerpo humanizado comprende el polipéptido de MEDI-493 de la Figura 8.

25. El uso de la reivindicación 19, en el que la cadena pesada del anticuerpo humanizado comprende el polipéptido

de cadena pesada de MEDI-493 de la Figura 7 y la cadena ligera del anticuerpo humanizado comprende el polipéptido de cadena ligera de MEDI-493 de la Figura 8.

26. El uso del anticuerpo humanizado de la reivindicación 1 para la preparación de una composición para el

tratamiento de la infección producida por el virus respiratorio sincitial en un ser humano. 30

27. El uso de la reivindicación 26, en el que la estructura de cadena pesada del anticuerpo humanizado comprende la estructura de cadena pesada de MEDI-493 de la Figura 7.

28. El uso de la reivindicación 26, en el que la estructura de cadena ligera del anticuerpo humanizado comprende la 35 estructura de cadena ligera de MEDI-493 de la Figura 8.

29. El uso de la reivindicación 26, en el que la estructura de cadena ligera del anticuerpo humanizado comprende la estructura de cadena ligera de MEDI-493 de la Figura 8 y la estructura de cadena pesada del anticuerpo humanizado comprende la estructura de cadena pesada de MEDI-493 de la Figura 7.

30. El uso de la reivindicación 26, en el que la cadena pesada del anticuerpo humanizado comprende el polipéptido de MEDI-493 de la Figura 7.

31. El uso de la reivindicación 26, en el que la cadena ligera del anticuerpo humanizado comprende el polipéptido de 45 MEDI-493 de la Figura 8.

32. El uso de la reivindicación 26, en el que la cadena pesada del anticuerpo humanizado comprende el polipéptido de cadena pesada de MEDI-493 de la Figura 7 y la cadena ligera del anticuerpo humanizado comprende el polipéptido de cadena ligera de MEDI-493 de la Figura 8.