Anticuerpos para la linfopoyetina estromal tímica (TSLP) y usos de la misma.

Un anticuerpo humano o humanizado aislado o un fragmento funcional del mismo que comprende una región deenlace con antígeno que es específica para la TSLP,

en donde el anticuerpo o fragmento funcional del mismo seenlaza con la TSLP y comprende una región variable pesada seleccionada de SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 ySEQ ID NO: 86 y una región variable de cadena ligera 5 SEQ ID NO: 88.

Anticuerpos para la linfopoyetina estromal tímica (TSLP) y usos de la misma Campo de la invención La presente invención se relaciona con los anticuerpos para la linfopoyetina estromal tímica humana (hTSLP) y especialmente con aquéllos que neutralizan la actividad de la hTSLP. Además, se refiere a los métodos para usar las moléculas de los anticuerpos anti-hTSLP para el diagnóstico o tratamiento de las enfermedades relacionadas con la hTSLP como el asma, la dermatitis atópica, la rinitis alérgica, la fibrosis, la enfermedad inflamatoria del intestino y el linfoma de Hodgkin.

Antecedentes de la invención La linfopoyetina estromal tímica humana (hTSLP) (Número de acceso Genbank: NM_033035) , una citoquina parecida a la interleucina (IL-7) , que es producida por las células cebadas y el estroma epitelial humano, inicia la respuesta antialérgica mediante la estimulación de las células dendríticas (DC) 1. La proteína de 159 aminoácidos deducida es 43 por ciento idéntica a la TSLP de ratón, contiene una secuencia de señales de 28 residuos, 6 cisteínas y 2 sitios de N-glicosilación supuesta. El análisis mediante electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato de sodio original, (SDS-PAGE) mostró la expresión de una proteína de 23 kilo-dáltones (kDa) , mientras que la masa molecular calculada de la proteína madura es de 14, 9 kDa, sugiriendo que la hTSLP es glucosilada. La hTSLP contiene 7 aminoácidos (aa) terminados en C básicos N-Lisina-Lisina-Arginina-ArgininaLisina-Arginina-Lisina-C (KKRRKRK) y 6 cisteínas probablemente participantes en la formación del enlace de disulfuro.

La hTSLP es altamente expresada por las células epiteliales de las amígdalas inflamadas y los queratinocitos de la dermatitis atópica y su expresión se asocia con la migración y la activación de las células de Langerhans2.

El complejo receptor de la TSLP es un heterodímero compuesto del receptor de la TSLP (TSLPR) y la cadena alfa del receptor IL-7 (IL-7 Ra) . El receptor se expresa principalmente en los monocitos y en las células dendríticas derivadas de mieloide, así como sobre los linfocitos B3.

La alergia es el resultado de una cascada inmune compleja que conduce a la producción desarreglada del subconjunto tipo 2 de las células ayudantes derivadas del Timo (Th2) de las citoquinas del linfocito, la generación de linfocitos B que producen las IgE específicas del alérgeno y la posterior activación y desgranulación de las células cebadas después del estímulo alergénico.

Las células dendríticas representan un papel importante en distintos modelos de alergia durante los cuales las células dendríticas humanas activadas por la TSLP producen la quimiocina que atrae a las Th2 pero no a la IL-12 e inducen la diferenciación del linfocito T positivo para el antígeno de CD4 y CD8 natural en las células efectoras con un fenotipo proalérgico típico.

La dermatitis atópica (AD) representa una enfermedad inflamatoria de la piel, recurrente, crónica con aspectos clínicos característicos4. Los antecedentes genéticos, las exposiciones ambientales, tales como los alérgenos de los alimentos, a los aereoalérgenos, a los antígenos microbianos, o al estrés y distintas predisposiciones inmunológicas contribuyen al desarrollo de las lesiones de la piel eccematosas con prurito, periódicas, en los pacientes afectados. Se han mostrado varios factores solubles aumentados en la sangre periférica de los pacientes con dermatitis atópica. Estas citoquinas y quimiocinas representan un papel importante para regular la diferenciación, la activación y la migración de las células dendríticas y son importantes para coordinar el tráfico de las células inmunes. La hTSLP que se produce mediante el estroma epitelial humano y las células cebadas, inicia la respuesta alérgica mediante la estimulación de las células dendríticas. Las células dendríticas cultivadas con la TSLP producen las quimiocinas CC que inducen la quimotaxis y la polarización de los linfocitos efectores específicos del alérgeno. La TSLP derivada de las células estromales y epiteliales representan uno de los factores que inician las respuestas alérgicas y podría ser un objetivo para un enfoque terapéutico curativo para la alergia.

En estudios recientes, se describió un anticuerpo policlonal anti-TSLP de humano (R&D Systems, AF1398) . Este anticuerpo se produjo en ovejas inmunizadas con TSLP recombinante derivada de E. Coli purificada. La IgG de oveja específica para la TSLP humana se purificó mediante cromatografía por afinidad con la hTSLP. Se seleccionó este anticuerpo policlonal por su capacidad para neutralizar la actividad biológica de la hTSLP y mostró menos de 1 por ciento de reactividad cruzada con la TSLP murina recombinante. La dosis de neutralización50 (ND50) para este anticuerpo se define como la concentración de anticuerpos requerida para producir la mitad de la inhibición máxima de la actividad de la hTSLP recombinante sobre las células BaF/3 de ratón de la línea celular responsiva cotransfectadas con cadenas de IL-7Ra y hTSLPR, como una prueba. Se determinó que la ND50 era de 0.05 a 0.25 microgramos/mililitro en la presencia de 0.5 nanogramos/mililitro de hTSLP recombinante. La desventaja de los anticuerpos policlonales es que están en un suministro limitado ya que hay un suministro restringido de suero del mismo animal tratado. En adición, los anticuerpos policlonales reconocen múltiples epitopos sobre el mismo antígeno y pueden tener reactividad cruzada no deseada. Aunque el suero policlonal contiene una mezcla de enlazantes de afinidad tanto alta como baja, alcanzando también una variedad de epitopos, un enfoque de anticuerpo monoclonal asegura seleccionar el candidato más útil para un uso terapéutico.

Los anticuerpos policlonales derivados de animales cuando se inyectan en humanos constituyen una proteína extraña en un anfitrión humano, frecuentemente provocan una respuesta de antiglobulina debido a su inmunogenicidad en humanos. Esta respuesta de antiglobulina, que predominantemente se dirige contra los dominios constantes de los anticuerpos de animal, usualmente dificulta el tratamiento después de la administración repetida.

Soumelis y colaboradores enseñan el posible papel de TSLP en inflamación alérgica (asma, dermatitis atópica y rinitis alérgica) en la que la TSLP se bloqueó mediante los mAbs de rata neutralizantes anti-TSLP de humano 5E5 y 12F3 comercialmente disponibles.

Finalmente, el documento WO03065985 da a conocer antagonistas, tales como un anticuerpo o un fragmento del mismo, contra TSLP (denominado en el mismo ILB50) para el tratamiento de inflamaciones alérgicas como asma, dermatitis atópica. El documento WO03065985, que se refiere a Soumelis y colaboradores y los anticuerpos dados a conocer en el mismo, describe qué regiones de TSLP podrían proporcionar un aumento de antigenicidad para generar un anticuerpo.

Sumario de la invención La invención proporciona un anticuerpo humano o humanizado aislado o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con la reivindicación 1.

En una modalidad, el anticuerpo aislado es una IgG1, IgG2 o una IgG4.

En otra modalidad, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende anticuerpos o fragmentos funcionales tal como se describe en el presente documento y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable para los mismos.

En una modalidad de la presente invención, el anticuerpo es una IgG1 que tiene una secuencia lambda de cadena ligera seleccionada de SEQ ID NO: 99 o SEQ ID NO: 101, y una secuencia de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111 y SEQ ID NO: 113.

En otro aspecto de la presente invención, se proporciona un polinucleótido recombinante o aislado que codifica un polipéptido que comprende una región de enlace con antígeno de un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo descrito anteriormente.

En una modalidad el polinucleótido es un ADN.

En otro aspecto de la presente invención se proporciona una célula huésped que comprende un primer y un segundo segmento de ADN recombinante que codifican una cadena pesada y una cadena ligera, respectivamente, del anticuerpo descrito anteriormente; en donde los segmentos de ADN están respectivamente de manera operativa enlazados a un primer y un segundo promotor y son capaces de expresarse en dicha célula huésped.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 describe el vector de expresión pMORPH®X9_Fab_FH de HuCAL® Fab (transportando el Fab MOR04494 anti-TSLP) F.

Descripción detallada de la invención La presente invención se relaciona con los anticuerpos aislados, particularmente... [Seguir leyendo]

1. Un anticuerpo humano o humanizado aislado o un fragmento funcional del mismo que comprende una región de enlace con antígeno que es específica para la TSLP, en donde el anticuerpo o fragmento funcional del mismo se enlaza con la TSLP y comprende una región variable pesada seleccionada de SEQ ID NO: 84, SEQ ID NO: 85 y

SEQ ID NO: 86 y una región variable de cadena ligera SEQ ID NO: 88.

2. El anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 1, que es una IgG1, IgG2 o una IgG4.

3. El anticuerpo aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 que es una IgG1 que tiene una secuencia lambda de cadena ligera seleccionada de SEQ ID NO: 99 o SEQ ID NO: 101, y una secuencia de cadena pesada seleccionada de SEQ ID NO: 103, SEQ ID NO: 105, SEQ ID NO: 107, SEQ ID NO: 109, SEQ ID NO: 111 y

SEQ ID NO: 113.

4. Un polinucleótido aislado o recombinante que codifica un polipéptido que comprende una región de enlace con antígeno de un anticuerpo o un fragmento funcional del mismo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 o un anticuerpo aislado de acuerdo con la reivindicación 3.

5. El polinucleótido de la reivindicación 4, que es un ADN.

6. Una célula huésped aislada que comprende un primer y un segundo segmento de ADN recombinante que codifican una cadena pesada y una cadena ligera, respectivamente, del anticuerpo de la reivindicación 3; en donde dichos segmentos de ADN están respectivamente de manera operativa enlazados a un primer y un segundo promotor, y son capaces de expresarse en dicha célula huésped.

7. Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento funcional del mismo de acuerdo con 20 una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptable para el mismo.