Anticuerpos multiespecíficos.

Método de fabricación de un anticuerpo multiespecífico que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL),

en el que la pareja de VH y VL juntos forman un sitio de unión a antígeno único capaz de unirse a un primer epítopo y un segundo epítopo, comprendiendo el método las etapas de: (1) diversificar la secuencia de aminoácidos de la VL, en el que antes de la diversificación, el sitio de unión a antígeno es capaz de unirse sólo al primer epítopo, y (2) seleccionar un anticuerpo diversificado en el que el sitio de unión a antígeno es capaz de unirse al primer epítopo y al seguno epítopo.

Anticuerpos multiespecíficos.

REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica en beneficio de la solicitud de Estados Unidos de número de serie 60/841, 350 solicitada el 30 de agosto de 2006 y la solicitud de Estados Unidos de número de serie 60/937, 814, solicitada el 28 de junio de 2007.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a anticuerpos multiespecíficos y métodos de fabricación y utilización de dichos anticuerpos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los anticuerpos son polipéptidos de inmunoglobulinas específicas producidos por el sistema inmune vertebrado en respuesta a la estimulación por proteínas, glicoproteínas, células exógenas u otras sustancias exógenas antigénicas. Una parte importante de este proceso es la generación de anticuerpos que se unen específicamente a una sustancia exógena particular. La especificidad de unión de dichos polipéptidos a un antígeno particular es muy refinada y la multitud de especificidades capaces de ser generadas por el vertebrado individual es destacable en su complejidad y variabilidad. Miles de antígenos son capaces de producir respuestas, cada una dirigida casi exclusivamente al antígeno particular que la produjo.

El reconocimiento específico de antígenos es esencial para anticuerpos para funcionar en la respuesta inmune adaptiva. La asociación combinatoria de la cadena pesada (HC) y cadena pesada (LC) se conserva en todos los vertebrados en la generación del repertorio de anticuerpos. Sin embargo, existe una asimetría de la diversidad en las dos cadenas. El dominio variable de HC (VH) de HC (VH) contiene una diversidad de secuencia significativamente más elevada y contribuye en los determinantes de reconocimiento de antígeno más a menudo que el dominio variable de la LC (VL) . El papel de la LC en la determinación de la especificidad de antígeno se indica por un proceso denominado edición del receptor. La recombinación en desarrollo de los genes de CL para editar el receptor de células B es el principal mecanismo para corregir los precursores de los anticuerpos autoreactivos, que parecen constituir una parte significativa del repertorio inicial ( 75%) . La alteración de la cadena ligera demuestra que se extingue la especificidad de unión o multiespecificidad no deseada. [0005] La especificidad de anticuerpos y fragmentos de anticuerpos para un antígeno o antígenos particulares hace de los anticuerpos agentes terapéuticos deseables. Los anticuerpos y fragmentos de anticuerpos se puedne utilizar para reconocer tejidos particulares, por ejemplo, un tumor, y de este modo, minimizar los efectos secundarios potenciales de reconocimiento no específico. Por tanto, existe una necesidad actual y continua para identificar y caracterizar anticuerpos terapéuticos, especialmente anticuerpos, fragmentos y derivados de los mismos, útiles en el tratamiento del cáncer y otros trastornos proliferativos.

DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona un método de fabricación de un anticuerpo multiespecífico que comprende las etapas de (1) diversificar la secuencia de aminoácidos de un dominio variable de cadena ligera (VL) de un anticuerpo, donde antes de la diversificación, el anticuerpo comprendía una VL y un dominio variable de cadena pesada (VH) capaz de unirse a un primer epítopo y (2) seleccionar un anticuerpo diversificado capaz de unirse al primer epítopo y un segundo epítopo tal como se define en las reivindicaciones. Antes de la diversificación, el anticuerpo en la etapa 1 es monoespecífico. Según una realización, el VL/VH del anticuerpo después de utilizar los métodos de la presente invención, es biespecífico. En una realización, la secuencia de aminoácidos de VL se diversifica mediante la alteración de la secuencia de ácidos nucleicos que codifica el VL y la expresión del VL diversificado. En una realización adicional, la diversificación es mediante la alteración de un conjunto de posiciones de residuos de aminoácidos predeterminadas. Según una realización, los residuos se diversifican en base a la diversidad de un conjunto de secuencias de aminoácidos de cadena ligera naturales. Adicionalmente o alternativamente, los residuos se diversifican en base a la accesibilidad al disolvente. Según una realización, el VL diversificado se expresa en fagos con el VH durante la etapa de selección. Según una realización adicional, la afinidad de unión del anticuerpo multiespecífico se puede mejorar mediante el sometimiento del anticuerpo a maduración por afinidad (por ejemplo, rastreo de homólogos u otras mutaciones del VL y/o VH) .

Según una realización, las posiciones de residuos diversificadas se seleccionan del grupo que consiste en:

(1) posiciones 28, 30-32, 66-70, 92-93, opcionalmente en las posiciones 30a-e y 93 (a) - (b) ; (2) posiciones 28, 30-32, 66-70, 92-93, opcionalmente en las posiciones 30a-f; (3) posiciones 28-32, 50-53, 92-93, opcionalmente en las posiciones 30a-f y 93a-b; (4) posiciones 28, 30-32, 50-53, 92-93, opcionalmente en las posiciones 30a-f y 93a-b; (5) posiciones 28-32, 50-53, 92-93; (6) posiciones 28-32, 50-53, 92-93, opcionalmente en 30a-b (7) posiciones 28-32, 50-53, 91-93, 94, opcionalmente en 30a-f y 93a-b; y (8) posiciones 29-32, 50-53, 66-67, 69-70, 92-93, 94, opcionalmente en 30a-f. Según una realización preferida, los residuos de VL se diversifican según una cualquiera de los diseños de biblioteca descritos en la figura 1.

Según una realización, la etapa de selección para unirse al primer epítopo o la selección para unirse al segundo epítopo tiene lugar en presencia de VL y VH diversificadas. Según otra realización, la VL y VH diversificadas se pueden unir al primer epítopo y al segundo epítopo de manera simultánea. En una realización alternativa, la VL y VH diversificadas se unen al primer epítopo y al segundo epítopo excluidos mutuamente. En una realización, el primer epítopo es de una molécula biológica y el segundo epítopo es de la misma molécula biológica. En otra realización, el primer epítopo es de una molécula biológica y el segundo epítopo es de una segunda molécula biológica. Según una realización, la primera molécula biológica y la segunda molécula biológica son estructuralmente no similares.

Según una realización, se seleccionan parejas de primera molécula biológica y segunda molécula biológica del siguiente grupo de parejas: VEGF/HER2, VEGF-A/HER2, HER2/DR5, VEGF-A/PDGF, HER1/HER2, CD20/BR3, VEGF-A/VEGF-C, VEGF-C/VEGF-D, TNFalfa/TGF-beta, 1-NFalfa/IL-2, TNF alfa/IL-3, TNFalfa/IL-4, TNFalfa/IL-5, TNFalfa/IL6, TNFalfa/IL8, TNFalfa/IL-9, TNFalfa/IL-10, TNFalfa/IL-11, TNFalfa/IL-12, TNFalfa/IL-13, TNFalfa/IL-14, TNFalfa/IL-15, TNFalfa/IL-16, TNFalfa/IL-17, TNFalfa/IL-18, TNFalfa/IL-19, TNFalfa/IL-20, TNFalfa/IFNalfa, TNFalfa/CD4, VEGF/IL-8, VEGF/MET, VEGFR/receptor de MET, HER2/Fc, HER2/HER3; EGFR/HER2, EGFR/HER3, EGFR/HER4, TNFalfa/IL-3, TNFalfa/IL-4, IL-13/CD40L, IL4/CD40L, TNFalfa/ICAM-1, TNFR1/IL-1R, TNFR1/IL-6R y TNFR1/IL-18R. En realizaciones particulares, la primera molécula biológica y la segunda molécula biológica son VEGF/HER2, HER2/DR5, o HER2/Fc.

Según una realización, una de las moléculas biológicas es una molécula que puede incrementar la semivida del anticuerpo multiespecífico cuando se une al anticuerpo in vivo. En otra realización, la molécula biológica es albúmina de suero o el receptor de Fc neonatal (FcRn) .

Según otra realización, una de las moléculas biológicas es una molécula que puede incrementar la función efectora de un anticuerpo multiespecífico cuando se une al anticuerpo in vivo. En una realización, la molécula biológica se une a una proteína de la superficie celular en células asesinas naturales o macrófagos. La proteína de la superficie celular puede ser C1q o un receptor de Fc.

La presente invención también proporciona anticuerpos multiespecíficos fabricados mediante los métodos de la presente invención. Se contempla que un anticuerpo multiespecífico de la presente invención puede comprender uno o un conjunto de los dominios VL/VH creados por los métodos de la presente invención solos o en combinación con los dominios hipervariables de anticuerpos no creados por los métodos de la presente invención. Un anticuerpo multiespecífico de la presente invención puede existir en un conjunto de formas (por ejemplo, fragmentos de anticuerpos, multiméricos, etc) . Según una realización, el anticuerpo multiespecífico es cualquiera de los anticuerpos de las figuras 5-10, 13-16, figura 34, figura 39, y la tabla 2. En una realización particular, el anticuerpo multiespecífico es un anticuerpo bH1 de la figura 34 o un fragmento del mismo.

Los... [Seguir leyendo]

1. Método de fabricación de un anticuerpo multiespecífico que comprende un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL) , en el que la pareja de VH y VL juntos forman un sitio de unión a antígeno único capaz de unirse a un primer epítopo y un segundo epítopo, comprendiendo el método las etapas de:

(1) diversificar la secuencia de aminoácidos de la VL, en el que antes de la diversificación, el sitio de unión a antígeno es capaz de unirse sólo al primer epítopo, y (2) seleccionar un anticuerpo diversificado en el que el sitio de unión a antígeno es capaz de unirse al primer epítopo y al seguno epítopo.

2. Método según la reivindicación 1, en el que la secuencia de aminoácidos de VL se diversifica mediante la alteración de la secuencia de ácido nucleico que codifica el VL y que expresa el VL diversificado.

3. Método según la reivindicación 1, en el que una pluralidad de posiciones de residuos de aminoácidos predeterminados están marcados para la diversificación.

4. Método según la reivindicación 3, en el que los residuos se diversifican en base a la diversidad de una pluralidad de secuencias de aminoácidos de cadena ligera naturales o en base a la accesibilidad al disolvente.

5. Método según la reivindicación 1, en el que las posiciones diversificadas de residuos de VL se seleccionan del grupo que consiste en: (1) posiciones 28.

3. 32.

6. 70.

9. 93 de la secuencia de aminoácidos de VL, opcionalmente en las posicione.

30. e y 93 (a) - (b) de la secuencia de aminoácidos de VL; (2) posiciones 28.

3. 32.

6. 70.

9. 93 de la secuencia de aminoácidos de VL, opcionalmente en las posicione.

30. f de la secuencia de aminoácidos de VL;

(3) posicione.

2. 32.

5. 53.

9. 93 de la secuencia de aminoácidos de VL, opcionalmente en las posicione.

30. f .

93. b de la secuencia de aminoácidos de VL; (4) posiciones 28.

3. 32.

5. 53.

9. 93 de la secuencia de aminoácidos de VL, opcionalmente en las posicione.

30. f .

93. b de la secuencia de aminoácidos de VL; (5) posicione.

2. 32.

5. 53.

9. 93 de la secuencia de aminoácidos de VL; (6) posicione.

2. 32.

5. 53.

9. 93 de la secuencia de aminoácidos de VL, opcionalmente en las posicione.

30. b de la secuencia de aminoácidos de VL; (7) posiciones 2832.

5. 53.

9. 93, 94 de la secuencia de aminoácidos de VL, opcionalmente en las posicione.

30. f .

93. b de la secuencia de aminoácidos de VL; y (8) posicione.

2. 32.

5. 53.

6. 67.

6. 70.

9. 93, 94 de la secuencia de aminoácidos de VL, opcionalmente en las posicione.

30. f de la secuencia de aminoácidos de VL.

6. Método según la reivindicación 1, en el que las posiciones de residuos de VL diversificadas se selecionan del grupo que consiste en: posiciones 28, 29, 30, 31, 32, 50, 51, 53, 91, 92, 93 and 94 de la secuencia de aminoácidos de VL.

7. Método según la reivindicación 1, en el que los residuos de VL se diversifican según cualquiera de los diseños de biblioteca mostrados en la figura 1.

8. Método según la reivindicación 1, en el que el VL diversificado se expresa en fagos con el VH durante la etapa de selección.

9. Método según la reivindicación 1, en el que el anticuerpo antes de la diversificación comprende:

(i) una CDR-H1 que comprende IKDTYI (SEQ ID NO:1) , una CDR-H2 que comprende ARIYPTNGYTRY (SEQ ID NO:2) , y una CDR-H3 que comprende RWGGDGFY (SEQ ID NO:3) , y en el que, opcionalmente, el anticuerpo comprende además una CDR-L1 que comprende DVSTAV (SEQ ID NO:4) , CDR-L2 que comprende SASF (SEQ ID NO:5) y una CDR-L3 que comprende HYTTPP (SEQ ID NO:6) ;

(ii) una CDR-H1 que comprende FTDYTM (SEQ ID NO: 7) , una CDR-H2 que comprende ADVNPNSGGSIY (SEQ ID NO:8) , y una CDR-H3 que comprende RNLGPSF (SEQ ID NO:9) , y en el que, opcionalmente, el anticuerpo comprende además una CDR-L1 que comprende DVSIGV (SEQ ID NO: 10) , CDR-L2 que comprende SASY (SEQ ID NO:11) y una CDR-L3 que comprende YYIYPY (SEQ ID NO: 12) ; o

(iii) una CDR-H1 que comprende ISDSGI (SEQ ID NO: 13) , una CDR-H2 que comprende AAIAPGAGSTYY (SEQ ID NO: 14) , y una CDR-H3 que comprende RFVSAPPS (SEQ ID NO: 15) , y en el que, opcionalmente, el anticuerpo comprende además una CDR-L1 que comprende DVSTAV (SEQ ID NO: 16) , CDR-L2 que comprende SASF (SEQ ID NO: 17) y una CDR-L3 que comprende YSTVPW (SEQ ID NO: 18) .

10. Método según la reivindicación 1, en el que la etapa de selección para la unión al primer epítopo o la selección para la unión al segundo epítopo tiene lugar en presencia de VL y VH diversificados.

11. Método según la reivindicación 1, en el que

(i) los VL y VH diversificados se pueden unir al primer epítopo y al segundo epítopo simultáneamente, o

(ii) los VL y VH diversificados se unen al primer epítopo y al segundo epítopo de forma mutuamente exclusiva.

12. Método según la reivindicación 1, en el que

(i) el primer epítopo es de una molécula biológica y el segundo epítopo es de la misma molécula biológica, o

(ii) el primer epítopo es de una molécula biológica y el segundo epítopo es de una segunda molécula biológica.

13. Método según la reivindicación 12 (ii) , en el que la primera molécula biológica y la segunda molécula biológica se seleccionan del grupo que consiste en VEGF/HER2, VEGF-A/HER2, HER2/DRS, VEGF-A/PDGF, HER1/HER2, CD20/BR3, VEGF- A/VEGF-C, VEGF-C/VEGF-D, TNFalfa/TGF-beta, TNFalfa/IL-2, TNF alfa/IL-3, TNFalfa/IL-4, TNFalfa/IL-5, TNFalfa/IL6, TNFalfa/IL8, TNFalfa/IL-9, TNFalfa/IL-10, TNFalfa/IL-1, TNFalfa/IL-12, TNFalfa/IL-13, TNFalfa/IL-14, TNF alfa/IL-15, TNFalfa/IL-16, TNFalfa/IL-17, TNFalfa/IL-18, TNFalfa/IL-19, TNF alfa/IL-20, TNFalfa/IFNalfa, TNFalfa/CD4, VEGF/IL-8, VEGF/MET, receptor VEGFRIMET, HER2/Fc, HER2/HER3; EGFR/HER2, EGFR/HER3, EGFR/HER4, TNFalfa/IL-3, TNFalfa/IL-4, IL-13/CD40L, IL4/CD40L, TNFalfa/ICAM-1, TNFRIAL-IR, TNFR1/IL-6R, y TNFR1/IL-18R.

14. Método según la revindicación 13, en el que dicha primera molécula biológica y segunda molécula biológica son:

(i) VEGF/HER2;

(ii) HER2/DR5; o

(iii) HER2/Fc.

15. Método según la reivindicación 12 (ii) , en el que una de las moléculas biológicas es una molécula que puede incrementar la semivida del anticuerpo multiespecífico cuando se une al anticuerpo in vivo.

16. Método según la reivindicación 15, en el que la segunda molécula biológica es albúmina de suero o un receptor de Fc neonatal (FcRn) .

17. Método según la reivindicación 12 (ii) , en el que la segunda molécula biológica es una molécula que puede incrementar la función efectora de un anticuerpo multiespecífico cuando se une al anticuerpo in vivo.

18. Método según la reivindicación 17, en el que la segunda molécula biológica se une a una proteína de la superficie celular en células asesinas naturales o macrófagos, y en el que, opcionalmente, dicha proteína de la superficie celular en un receptor de Fc o C1q.

19. Método según la reivindicación 1, en el que dicho anticuerpo multiespecífico es capaz de unirse al primer epítopo

o al segundo epítopo con una KD de por lo menos 10-6 M.

20. Método según la reivindicación 19, en el que dicho anticuerpo multiespecífico es capaz de unirse al primer epítopo o al segundo epítopo con una KD de por lo menos 10-9 M.

21. Método según la reivindicación 19, en el que dicho anticuerpo multiespecífico es capaz de unirse al primer epítopo y al segundo epítopo con una KD de por lo menos 10-6 M.