Anticuerpos cristalinos anti-hTNF alfa.

Un método de cristalización discontinua para cristalizar un anticuerpo IgG humano anti-hTNF alfa,

comprendiendoel método las etapas de:

(a) proporciona una solución acuosa del anticuerpo en mezcla con una sal de fosfato inorgánico para obteneruna mezcla acuosa de cristalización, donde la mezcla acuosa de cristalización tiene una concentración de sal defosfato inorgánico de 1 M a 6 M; y

(b) incubar la mezcla acuosa de cristalización hasta que se formen cristales del anticuerpo,

donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende la secuencia deaminoácidos de la SEC ID Nº 1 y una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la secuencia deaminoácidos de la SEC ID Nº 2.

Anticuerpos cristalinos anti-hTNF alfa La presente invención se refiere a un método de cristalización discontinuo para cristalizar un anticuerpo anti-hTNF alfa que permita la producción de dicho anticuerpo a escala industrial; a los cristales de anticuerpo obtenidos de acuerdo con dicho método; a las composiciones que contienen dichos cristales así como a dichos cristales y composiciones para uso en medicina.

Antecedentes técnicos a) Cristales de anticuerpo Con más de 100 anticuerpos monoclonales siendo evaluados actualmente en fases de estudio clínico 2 o 3, el

mercado de los mAb puede considerarse uno de los mercados biofarmacéuticos más prometedores. Como estos fármacos tienen que suministrarse en dosis individuales que a menudo exceden los 100 mg, hay una urgente necesidad de hallar estrategias adecuadas de formulación que satisfagan la estabilidad, la seguridad y la aceptación del paciente.

Sin embargo, las formulaciones líquidas de mAb altamente concentradas muestran viscosidad aumentada, lo que obstaculiza la capacidad de inyección a través de agujas delgadas apropiadas para el paciente. Además, la tendencia de agregación de las moléculas mAb a dichas altas concentraciones aumenta exponencialmente cuando se compara con soluciones moderadamente concentradas. Esto es inaceptable, en resumen, respecto a los requisitos de seguridad y estabilidad.

Por tanto, el suministro de elevadas dosis de mAb está restringido a grandes volúmenes, que generalmente tienen que suministrarse mediante infusión. Este modo de dosificación es muy costoso y reduce significativamente la aceptación del paciente.

Por lo tanto, serían altamente deseables suspensiones de cristales de mAb de bajo volumen farmacéuticamente aplicables para inyección subcutánea. Teóricamente, las vías de degradación que influyen en la integridad de los mAb deben desacelerarse significativamente debido a la rigidez de una red cristalina, donde los movimientos en la estructura proteica están impedidos. Además, puede esperarse que el aumento en la viscosidad se redujera significativamente cuando se comparan suspensiones cristalinas altamente concentradas con formulaciones líquidas. Con respecto a la liberación sostenida, puede ser posible generar o alterar cristales de proteínas en un modo que disuelvan lentamente cuando se sitúan en el cuerpo del paciente. Esto sería un modo muy elegante de suministrar una formulación de liberación sostenida, ya que el uso extensivo de excipientes y los procesos que dañan la estructura de los mAb se evitarían.

A pesar del enorme potencial en el uso de cristales de proteínas como sustancia de fármaco, se han hecho pocos intentos de evaluar sistemáticamente esta estrategia.

Una exención bien conocida es la insulina, que se cristalizó satisfactoriamente hace décadas. Hoy en día, el uso de suspensiones cristalinas de insulina está bien descrito, ofreciendo formulaciones estables y de larga acción que 45 están bien establecidas en el mercado. La discrepancia entre el desarrollo de cristales de insulina y la cristalización de todas las demás proteínas puede estar relacionada con el hecho de que los agregados ordenados de insulina se forman de forma nativa en el páncreas. Por tanto, los cristales de insulina se obtienen fácilmente cuando la insulina se pone en contacto con un exceso de iones zinc. La mayoría de las demás proteínas tienden a formar precipitados no ordenados en lugar de cristales, y por lo tanto, hallar condiciones de cristalización para una proteína es una tarea no trivial que consume mucho tiempo.

A pesar del gran interés en recolectar cristales de proteínas para análisis de difracción por rayos x, la cuestión de hallar condiciones de cristalización adecuadas aún es una ciencia empírica, ya que en principio cualquier proteína se comporta de forma diferente. Hasta la fecha, no se ha hallado ninguna norma general que pudiera predecir de forma 55 fiable mediante razonamiento solamente una condición de cristalización satisfactoria para una proteína de elección. Por tanto, obtener cristales de una proteína dada siempre se menciona como el "cuello de botella" de cualquier aplicación pretendida planeada después de ello.

Para hacer las cosas aún más desafiantes, los anticuerpos están descritos como especialmente difíciles de cristalizar, debido a la flexibilidad de la molécula.

No obstante, se conocen desde hace tiempo ejemplos de cristales de inmunoglobulina. El primer ejemplo de cristales de inmunoglobulina se describió hace 150 años por un médico inglés, Henr y Bence Jones; aisló cristales de un dímero anormal de cadena ligera de Ig de la orina de un paciente con mieloma (Jones 1848) . Dichas Ig 65 anormales se han conocido desde entonces como proteínas de Bence Jones. En 1938, se describió la cristalización espontánea de una Ig anormal distinta del suero de un paciente con mieloma (von Bonsdorf, Groth et al. 1938) ,

aparentemente un oligómero de cadena pesada de Ig (PM 200 kDa) . Se describieron inmunoglobulinas humanas cristalinas de estructura normal (dos cadenas pesadas ligadas a dos cadenas ligeras) durante los siguientes treinta años, de nuevo principalmente aisladas de pacientes con mieloma (Putnam 1955) . Davies y sus colaboradores fueron los primeros en caracterizar la estructura de un anticuerpo de mieloma humano intacto, llamado "Dob",

usando cristalografía de rayos x (Terr y , Matthews et al. 1968) , y determinaron su estructura tridimensional en 1971 (Sarma, Silverton et al. 1971) . Su trabajo pionero fue seguido por el de otros, produciendo las estructuras cristalinas de la IgG "Kol" (Huber, Deisenhofer et al. 1976) , la IgG "Mcg" (Rajan, Ely et al. 1983) , y la IgG2a de linfoma canino (Harris, Larson et al. 1992) .

Los cristales de inmunoglobulinas retienen sus actividades inmunológicas distintivas tras la redisolución. Nisonoff et al. informó en 1968 de un anticuerpo de conejo anti-p-azobenzoato, "X4", que se cristalizaba fácilmente. El anticuerpo X4 se caracterizó extensivamente antes de la cristalización así como después de la redisolución de los cristales. Se descubrió que [125I]-p-yodobenzoato se unía específicamente y potentemente a X4 redisuelto; los cristales redisueltos también mostraban múltiples reacciones de inmunodifusión de Ouchterlony específicas típicas del suero de conejo no purificado (Nisonoff, Zappacosta et al. 1968) . Connell y sus colaboradores describieron una inmunoglobulina gamma-1 kappa de mieloma humana (IgG-k) , llamada "Tem", que cristalizaba espontáneamente del suero a temperaturas frías (Connell, Freedman et al. 1973) . Se descubrió que los cristales de Tem se formaban bien y poseían simetría romboédrica. Se caracterizó extensivamente el suero que contenía Tem por técnicas de inmunodifusión en agarosa. La electroforesis y la inmunodifusión de una solución redisuelta de los cristales Tem demostraron que eran idénticos al material obtenido del suero por crioprecipitación, y a la proteína de mieloma aislada (Connell, Freedman et al. 1973) .

Mills y sus colaboradores informaron en 1983 de una cristalocrioglobulinemia inusual resultante de anticuerpos monoclonales humanos contra albúmina (Mills, Brettman et al. 1983) . Aquí, se aislaron cristales cuboides muy

similares de dos pacientes. La redisolución de los cristales seguida por electroforesis e inmunoelectroforesis indicó que los cristales estaban compuestos por dos componentes proteicos, una IgG-lambda monoclonal y albúmina sérica humana en una proporción 1:2 (Jentoft, Dearborn et al. 1982) . Los componentes se separaron a escala preparativa por disolución de los cristales originales seguida por cromatografía en columna. Aunque ningún componente separado cristalizaba por sí mismo, tras la recombinación se reformaba el complejo bipartito original y después cristalizaba. Un estudio adicional de las características de sedimentación distintivas y la reactividad inmunológica de la IgG separada redisuelta y su fragmento Fab con albúmina sérica humana indicó que la reasociación de los dos componentes separados redisueltos era de naturaleza inmunológica, es decir, que el anticuerpo cristalino una vez redisuelto aún poseía sus características de unión nativas, altamente específicas (por albúmina sérica humana) (Mills, Brettman et al. 1983) .

Recientemente, Margolin y sus colaboradores informaron de los usos terapéuticos potenciales de anticuerpos cristalinos (Yang, Shenoy et al. 2003) . Descubrieron que el anticuerpo monoclonal terapéutico trastuzumab (Herceptin®) podía cristalizarse (Shenoy, Govardhan et al. 2002) . Las suspensiones de trastuzumab cristalino eran terapéuticamente eficaces en un modelo de tumor de ratón, demostrando de este modo... [Seguir leyendo]

1. Un método de cristalización discontinua para cristalizar un anticuerpo IgG humano anti-hTNF alfa, comprendiendo el método las etapas de: 5

(a) proporciona una solución acuosa del anticuerpo en mezcla con una sal de fosfato inorgánico para obtener una mezcla acuosa de cristalización, donde la mezcla acuosa de cristalización tiene una concentración de sal de fosfato inorgánico de 1 M a 6 M; y

(b) incubar la mezcla acuosa de cristalización hasta que se formen cristales del anticuerpo,

donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 y una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 2.

2. El método de cristalización de acuerdo con la reivindicación 1, donde el pH de dicha mezcla acuosa de cristalización está en el intervalo de pH 3 a 5.

3. El método de cristalización de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la mezcla acuosa de cristalización contiene un tampón.

4. El método de cristalización de acuerdo con la reivindicación 3, donde el tampón comprende un tampón acetato.

5. El método de cristalización de acuerdo con la reivindicación 4, donde el tampón comprende acetato sódico.

6. El método de cristalización de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, donde la concentración de tampón en la mezcla acuosa de cristalización es de 0 M a 0, 5 M.

7. El método de cristalización de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la sal de fosfato es una sal de hidrogenofosfato.

8. El método de cristalización de acuerdo con la reivindicación 7, donde la sal de fosfato es una sal de metal alcalino,

o una mezcla de al menos dos sales diferentes de metal alcalino.

9. El método de cristalización de acuerdo con la reivindicación 1, donde la concentración de la sal de fosfato 35 inorgánico en la mezcla de cristalización está en el intervalo de 1, 0 a 3, 0 M.

10. El método de cristalización de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde se cumple al menos una de las siguientes condiciones adicionales de cristalización:

a) la incubación se realiza durante entre 1 hora a 60 días; b) la incubación se realiza a una temperatura entre 4ºC y 37ºC; c) la concentración del anticuerpo está en el intervalo de 0, 5 a 100 mg/ml.

11. El método de cristalización de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, que comprende 45 adicionalmente la etapa de secar los cristales y/o intercambiar las aguas madre con un tampón diferente.

12. El método de cristalización de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el volumen del lote está en el intervalo de 1 ml a 20000 l.

13. Un cristal de un anticuerpo IgG humano anti-hTNF alfa aislado e intacto, que se puede obtener mediante un método de cristalización definido en una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el anticuerpo comprende una región variable de cadena ligera (LCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 1 y una región variable de cadena pesada (HCVR) que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº

2. 55

14. El cristal de acuerdo con la reivindicación 13, donde el cristal tiene una morfología de tipo aguja con una longitud máxima d.

2. 500 !m y una proporción l/d de 3 a 30.

15. El cristal de acuerdo con la reivindicación 13 o 14, donde el anticuerpo es un anticuerpo no glucosilado.

16. El cristal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13, 14, o 15, donde el anticuerpo IgG se selecciona entre el grupo que consiste en un anticuerpo IgG1, un anticuerpo IgG2, un anticuerpo IgG3 y un anticuerpo IgG4.

17. El cristal de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 13 o 14, donde el anticuerpo es D2E7 (adalimumab) .

18. Una composición farmacéutica que comprende: (a) cristales del anticuerpo humano anti-hTNF alfa definido en una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, y (b) al menos un excipiente farmacéutico; proporcionándose dicha composición como una formulación sólida, semisólida o líquida, conteniendo cada formulación el anticuerpo en forma cristalina.

19. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 18, donde el al menos un excipiente integra o encapsula los cristales del anticuerpo.

20. La composición de acuerdo con la reivindicación 18, donde la composición tiene una concentración de anticuerpo mayor de 1 mg/ml.

21. La composición de acuerdo con la reivindicación 18, donde la composición tiene una concentración de anticuerpo mayor de 200 mg/ml.

22. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 21, donde el excipiente comprende al menos un vehículo polimérico opcionalmente biodegradable o al menos un vehículo oleoso o lípido.

23. La composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 18, donde el anticuerpo está en una concentración en el intervalo de 10 a 400 mg/ml.

24. Una suspensión de cristales que comprende los cristales del anticuerpo humano anti-hTNF alfa definidos en una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17, teniendo la suspensión de cristales una concentración de anticuerpo mayor de 100 mg/ml.

25. Un cristal que comprende el anticuerpo humano anti-hTNF alfa aislado definido en una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17 para su uso en el tratamiento de un mamífero mediante la administración al mamífero de una cantidad eficaz del anticuerpo cristalino anti-hTNF alfa.

26. Una composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 18 a 22 para su uso en el tratamiento de un mamífero mediante la administración al mamífero de una cantidad eficaz de la composición.

27. La composición de acuerdo con la reivindicación 26, donde la composición se administra por vía parenteral, vía oral, o por inyección.

28. Cristales de anticuerpo definidos en una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17 para su uso en el tratamiento de un trastorno relacionado con TNF alfa en un sujeto, mediante la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de los cristales de anticuerpo, donde dicho trastorno se selecciona entre el grupo que consiste en una enfermedad autoinmune, en particular artritis reumatoide, espondilitis reumatoide, osteoartritis y artritis gotosa, una alergia, esclerosis múltiple, diabetes autoinmune, uveítis autoinmune y síndrome nefrótico; una enfermedad infecciosa, rechazo de trasplante o enfermedad de injerto contra hospedador, neoplasia, trastorno pulmonar, trastorno intestinal, trastorno cardiaco, trastornos óseos inflamatorios, enfermedad de resorción ósea, hepatitis alcohólica, hepatitis vírica, hepatitis fulminante, alteraciones de la coagulación, quemaduras, lesión por reperfusión, formación de queloides, formación de tejido cicatrizal, pirexia, enfermedad periodontal, obesidad y toxicidad por radiación; una espondiloartropatía, un trastorno pulmonar, un trastorno coronario, un trastorno metabólico, anemia,

dolor, un trastorno hepático, un trastorno cutáneo, un trastorno de las uñas, o vasculitis, enfermedad de Behcet, espondilitis anquilosante, asma, enfermedad pulmonar obstructiva crónica (COPD) , fibrosis pulmonar idiopática (IPF) , reestenosis, diabetes, anemia, dolor, un trastorno relacionado con la enfermedad de Crohn, artritis reumatoide juvenil (JRA) , una infección por el virus de la hepatitis C, psoriasis, artritis psoriásica, y psoriasis con placas crónicas, caquexia relacionada con la edad, enfermedad de Alzheimer, edema cerebral, lesión cerebral inflamatoria, síndrome de fatiga crónica, dermatomiositis, reacciones a fármacos, edema en y/o alrededor de la medula espinal, fiebres periódicas familiares, síndrome de Felty, fibrosis, glomerulonefritis (por ejemplo, glomerulonefritis posterior a estreptococos o nefropatía por IgA) , pérdida de prótesis, poliangiítis microscópica, trastorno de tejido conectivo mixto, mieloma múltiple, cáncer y caquexia, trastorno orgánico múltiple, síndrome mielodisplásico, orquitis, osteólisis, pancreatitis, incluyendo abscesos agudos, crónicos y pancreáticos, enfermedad periodontal, polimiositis, fallo renal

progresivo, pseudogota, pioderma gangrenoso, policondritis recidivante, enfermedad cardiaca reumática, sarcoidosis, colangitis esclerosante, apoplejía, reparación de aneurisma aórtico toracoabdominal (TAAA) , síndrome periódico asociado al receptor de TNF (TRAPS) , síntomas relacionados con vacunación de fiebre amarilla, enfermedades inflamatorias asociadas con el oído, inflamación crónica del oído, o inflamación pediátrica del oído, uveítis, ciática, prostatitis, endometriosis, neovascularización coroidal, lupus, síndrome de Sjogren, y degeneración macular húmeda.

29. Un cristal que comprende el anticuerpo humano anti-hTNF alfa aislado definido en una cualquiera de las reivindicaciones 13 a 17 para su uso en medicina.

30. Una composición que comprende el cristal de la reivindicación 13, donde dicha composición comprende más del 95% de cristales del anticuerpo humano anti-hTNF alfa.

31. La composición de acuerdo con la reivindicación 30, donde el anticuerpo es D2E7 (adalimumab) .