Anticuerpos con actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos mejorada, métodos para su producción y uso.

El uso de células epiteliales mamarias de mamíferos no humanos para mejorar la actividad de ADCC de un anticuerpo o anticuerpos del isotipo IgG en comparación con un anticuerpo o anticuerpos derivados de un cultivo de células,

en donde dichas células son de un mamífero no humano tratado mediante ingeniería genética para expresar el anticuerpo en su leche, y en donde el modelo de glicosilación del anticuerpo se modifica produciendo el anticuerpo en las células.

Anticuerpos con actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos mejorada, métodos para su producción y uso SOLICITUDES RELACIONADAS

Esta solicitud reivindica prioridad bajo 35 U.S.C § 119 de la solicitud provisional de EE.UU. número de serie 60/729054, presentada el 21 de octubre de 2005.

APOYO DEL GOBIERNO

Aspectos de la invención pueden haberse realizado utilizando la financiación del National Cancer Institute SBIR, Número de concesión 5R43CA107608-02. Por consiguiente, el gobierno puede tener derechos en la invención.

CAMPO DE LA INVENCIÓN

Los autores de la invención describen anticuerpos con actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC – siglas en inglés) mejorada, métodos para su producción así como métodos para su uso.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los anticuerpos monoclonales son un arma importante en el arsenal de terapias contra enfermedades. Por ejemplo, ADCC es un contribuyente principal a la eficacia de anticuerpos anti-cáncer. El receptor clave que media en la ADCC es el receptor FcyIIIa (CD16) , un receptor de baja afinidad para IgG expresado en células asesinas naturales (NK – siglas en inglés) . Ratones deficientes para este receptor tienen una respuesta anti-tumor significativamente menor a rituximab (Clynes et al., 2000, Nat. Med 6: 443-446) . El receptor FcyIIIa juega un papel en mediar en la citotoxicidad de tumores en ratones (Clynes et al., 1998, PNAS 95: 652-656) . Un polimorfismo del gen FCGR3A que codifica el receptor FcyIIIa, que tiene una valina en la posición 158 en lugar de una fenilalanina, se une a IgG de manera más estrecha y confiere una actividad de ADCC mejorada en células NK (Wu et al., 1997, J Clin Invest 100: 1059-1070) . Este genotipo del gen FCGR3A, FCGR3A-158V/V, tiene un efecto positivo sobre la respuesta de los pacientes a rituximab en linfoma no- Hodgkin (Cartron et al., 2002, Blood 99: 754-758) , macroglobulinemia de Waldenstrom (Treon et al., 2005, J Clin Oncol 23: 474-481) , y el documento WO 2004/050847 enseña la producción de IgG en leche de mamíferos transgénicos. El documento WO 2004/009618 proporciona un método para producir mezclas de anticuerpos a partir de un solo clon de células hospedantes. la enfermedad autoinmune lupus eritematoso sistémico (SLE – siglas en inglés) (Anolik et al., 2003, Arthritis Rheum 48, 455-459) . El mismo polimorfismo ha sido también correlacionado con una mejor respuesta biológica en la enfermedad de Crohn a otro anticuerpo, infliximab (Louis et al., 2004, A Phar Ther 19: 511-519) . Estos hallazgos ilustran que ADCC juega un papel importante en la acción terapéutica de anticuerpos monoclonales en seres humanos. El aumento de la capacidad de anticuerpos terapéuticos para facilitar la actividad de ADCC, por lo tanto, tiene un valor terapéutico potencial.

Los anticuerpos humanos tienen dos sitios de glicosilación, uno en cada una de las cadenas pesadas idénticas. Experimentos iniciales utilizando inhibidores de la glicosilación y el procesamiento de hidratos de carbono encontraron que anticuerpos producidos en clones de hibridoma inhibidos tienen una actividad de ADCC mejorada (Rothman, 1989) . Un trabajo adicional demostró que tanto el estado de glicosilación como la actividad de ADCC de un anticuerpo se ven afectados por la línea celular en la que se produjo el anticuerpo (Lifely, 1995) . Varios grupos de investigación han demostrado que anticuerpos que carecen de la 1, 6-fucosa en su glicosilación de la cadena pesada, tienen una afinidad de unión mejorada al receptor FcyRIII y una actividad incrementada de ADCC (Shields et al., 2002; Shinkawa et al, 2002) . Además, se ha establecido una correlación entre la afinidad de unión al receptor FcyRIII y la actividad de ADCC (Okazaki, 2004; Dall’Ozzo, 2004) .

Se han generado líneas de células que son deficientes para “FUT8”, alfa-1, 6-fucosiltransferasa, que cataliza la transferencia de esta fucosa. Estas células inactivadas se pueden utilizar para producir anticuerpos con una mayor actividad de ADCC. Por ejemplo, se ha establecido una célula de ovario de hámster chino (CHO – siglas en inglés) deficiente en FUT8 (Yamane-Ohnuki et al., 2004) . También se ha utilizado ARN interferente pequeño (ARNsi) para bloquear la expresión del gen FUT8 (Mori et al., 2004) . Se ha utilizado una línea de células de rata para producir anticuerpos con actividad incrementada de ADCC (Niwa et al., 2004, 2005) . Además de su mayor actividad, IgG1 con bajo contenido en fucosa es independiente del polimorfismo FcyRIII, careciendo con ello de la diferencia observada con trastuzumab o rituximab en la célula de tipo salvaje (Niwa et al., 2004b, Vol 10 Clin Canc Res) .

Incluso a pesar de que se han producido previamente anticuerpos en una diversidad de sistemas de expresión, la actividad de ADCC mejorada de anticuerpos producidos en células epiteliales mamarias de mamíferos tales como las células epiteliales mamarias de mamíferos de un animal transgénico tratado mediante ingeniería genética para segregar el anticuerpo en su leche, no ha sido previamente reconocida.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

Se ha encontrado que anticuerpos producidos en células epiteliales mamarias de mamíferos tal como en las células epiteliales mamarias de mamíferos de un animal transgénico tratado mediante ingeniería genética para secretar anticuerpos en su leche, tienen una actividad de ADCC mejorada y una unión incrementada a CD16 en comparación con material derivado de cultivo de células. Estudios sobre la glicosilación de los anticuerpos derivados de la leche revelan menores contenidos en fucosa en los anticuerpos derivados de la leche. Por lo tanto, en esta memoria se describen anticuerpos y composiciones de los mismos. Los anticuerpos descritos son los producidos en células epiteliales mamarias de mamíferos. También se describen métodos para producir los anticuerpos, así como métodos para su uso.

Los anticuerpos con una actividad de ADCC mejorada se producen expresando los anticuerpos en células epiteliales mamarias de mamíferos. En una realización, células epiteliales mamarias de mamífero son las de un mamífero no humano transgénico tratado mediante ingeniería genética para expresar anticuerpos en su leche. En otra realización, las células epiteliales mamarias son células en cultivo transfectadas con una construcción de ácido nucleico (p. ej. ADN) que codifica la secuencia de un anticuerpo y que es capaz de provocar la expresión del anticuerpo en las células epitelias mamarias.

La invención se refiere a la reivindicación 1.

Los autores de la invención describen también una composición que comprende anticuerpos (o un anticuerpo) derivados de células epiteliales mamarias, en donde los anticuerpos tienen una actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) mejorada. Los autores de la invención describen también una composición que comprende anticuerpos (o un anticuerpo) derivados de la leche, en donde los anticuerpos derivados de la leche tienen actividad de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) mejorada. En una realización, la actividad ADCC de los anticuerpos es al menos el doble de alta que la actividad ADCC de anticuerpos derivados de un cultivo de células. En otra realización, la actividad ADCC de los anticuerpos es al menos tres veces, cuatro veces, cinco veces, siete veces o diez veces mayor que la actividad ADCC de anticuerpos derivados de cultivo de células. En una realización, la leche a partir de la cual se obtienen los anticuerpos derivados de la leche es la leche de un mamífero transgénico no humano tratado mediante ingeniería genética para expresar el anticuerpo.

De acuerdo con un aspecto de la invención, la unión de la región Fc de anticuerpos IgG1 se mejora si el anticuerpo carece de la fucosa del núcleo que se encuentra fijada al sitio de glicosilación Asn297 en la región Fc (p. ej., una fucosa enlazada a la base de la estructura biantenaria) . Los anticuerpos descritos en esta memoria carecen en algunos aspectos de esta fucosa del núcleo. Anticuerpos monoclonales producidos en la leche en otros aspectos son estructuras predominantemente con un alto contenido en manosa e híbridas. Generalmente, los anticuerpos descritos en esta memoria se pueden unir más estrechamente al receptor FcRIII y pueden resultar en una ADCC mejorada.

Los autores de la invención describen también anticuerpos que han sido modificados para tengan un modelo de glicosilación según se proporciona en esta memoria y, como resultado de ello, tengan actividad ADCC mejorada. La modificación es el resultado de producir el anticuerpo de modo que sea expresado en células epiteliales... [Seguir leyendo]

1. El uso de células epiteliales mamarias de mamíferos no humanos para mejorar la actividad de ADCC de un anticuerpo o anticuerpos del isotipo IgG en comparación con un anticuerpo o anticuerpos derivados de un cultivo de células, en donde dichas células son de un mamífero no humano tratado mediante ingeniería genética para expresar el anticuerpo en su leche, y en donde el modelo de glicosilación del anticuerpo se modifica produciendo el anticuerpo en las células.

2. El uso de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo está modificado de manera que al menos una cadena del anticuerpo no contiene fucosa.

3. El uso de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo está modificado de manera que el anticuerpo contiene una oligomanosa o una oligomanosa adicional.

4. El uso de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo está modificado de manera que los hidratos de carbono del anticuerpo exhiben un modelo de glicosilación con alto contenido en manosa.

5. El uso de la reivindicación 4, en donde el anticuerpo está modificado de manera que al menos una cadena del anticuerpo contiene oligomanosa y no está fucosilada.

6. El uso de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo está modificado de manera que el hidrato de carbono principal del anticuerpo no está fucosilado.

7. El uso de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo está modificado de manera que el hidrato de carbono principal del anticuerpo es una oligomanosa no fucosilada.

8. El uso de la reivindicación 7, en donde el anticuerpo está modificado de manera que el hidrato de carbono principal del anticuerpo es una Man5 no fucosilada.

9. El uso de la reivindicación 1, en donde el anticuerpo está modificado de manera que menos del 40% de los hidratos de carbono del anticuerpo contienen fucosa.

10. El uso de la reivindicación 1, en donde los anticuerpos están modificados de manera que al menos el 30% de los anticuerpos tienen al menos una oligomanosa.

11. El uso de la reivindicación 1, en donde al menos el 60% de los hidratos de carbono de los anticuerpos son una oligomanosa no fucosilada y menos del 40% de los hidratos de carbono de los anticuerpos contienen fucosa.

12. El uso de la reivindicación 1, en donde el mamífero no humano transgénico es una cabra, oveja, bisonte, camello, vaca, cerdo, conejo, búfalo, caballo, rata, ratón o llama.

13. El uso de la reivindicación 1, en donde las células epiteliales mamarias son células procedentes de cabra, oveja, bisonte, camello, vaca, cerdo, conejo, búfalo, caballo, rata, ratón o llama.

14. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde el anticuerpo es un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo totalmente humano.

15. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa.

16. El uso de la reivindicación 15, en donde el anticuerpo de longitud completa comprende una cadena pesada y una cadena ligera.

17. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo.

18. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en donde el anticuerpo es del isotipo IgG1 o IgG2.

19. El uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1-18, en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-CD137.