Anticuerpos capaces de detectar de manera selectiva isoformas del prión PrPSc.

Un anticuerpo unido exclusivamente a una isoforma PrPSc de la proteína prion y que reconoce el epitomé que tiene conformación tridimensional proporcionada por la secuencia de proteínas -Cys-Ile-Thr-Gln-TyrGlu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-de la isoforma PrPSc de la proteína prion mientras que no se une a la forma PrPC,

que se obtiene mediante un método que comprende el paso de inmunización de un animal con un enlace peptídico teniendo la secuencia de amino ácido -Cys-Ile-Thr-Gln-TyrGlu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-o -Cys-Ile-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-.

La presente invención pertenece a los anticuerpos originales dirigidos a la parte terminal C de la isoforma Prpsc de priones. En particular, el invento presente pertenece al uso de tales anticuerpos en el diagnóstico de encefalopatía espongiforme bovina (BSE) , la nueva variante de la Enfermedad de Creutzfeld-Jacobs (vCJD) , CJD esporádica y scarpie.

En 1986 en Reino Unido se diagnosticó una enfermedad degenerativa crónica. El ganado afectado por esta enfermedad experimentó una degeneración progresiva del sistema nervioso, manifestó cambios en el temperamento tales como nerviosismo o agresividad, posturas anormales, descoordinación y dificultad en el crecimiento, disminución de la producción de leche, o pérdida de peso a pesar de apetito continuo. El ganado afectado finalmente murió.

Esta enfermedad ha sido denominada Encefalopatía Espongiforme Bovina (BSE) y se suele referir a ella como "la enfermedad de las vacas locas". Durante los siguientes diez años, se confirmaron en Reino Unido aproximadamente 160.000 casos de esta nueva enfermedad de ganado, mientras también se encontraron casos en otros países europeos e incluso en el extranjero como en Canadá, las Islas Falkland yen el Sultanato Oman.

BSE se asocia con un agente transmisor cuya naturaleza aún se desconoce. El agente afecta al cerebro y a la médula espinal del ganado y las lesiones se caracterizan por cambios como los de las esponjas perceptibles a través de un microscopio. El agente es altamente estable, y resistente al calor a temperaturas normales e incluso a temperaturas más elevadas como las usadas para la pasteurización, esterilización, así como para la congelación o el secado.

En el ganado infectado con BSE, sólo se ha encontrado el agente BSE en el tejido cerebral, en la médula espinal yen la retina. Posteriores estudios han demostrado que también está presente en el ileo distal, la médula ósea, el ganglio dorsal y el ganglio trigeminal de terneros que han sido alimentados con partes del cerebro de animales infectados de BSE.

En seres humanos, se conoce un síndrome degenerativo similar que se denomina Enfermedad de CrutzfeldJacobs (CJD) . CJD es una lenta enfermedad humana degenerativa del sistema central nervioso con la evidente disfunción, demencia progresiva y degeneración vascular del cerebro. Tan sólo se han dado un caso por cada millón de habitantes en el mundo infectado con CJD. Aún más raras son las condiciones relacionadas con TSE (Encefalopatía Espongiforme Transmisible) del síndrome Gerstmann-Straussler, kuru e insomnio.

En 1996, el Comité Consejero de Encefalopatía Esponjiforme (SEAC) anunció la identificación de 10 casos de una nueva variante de CJD (vCJD) . Todos los pacientes desarrollaron la aparición de la enfermedad en 1994 y 1995. Sin embargo, los 10 casos difirieron en un alto grado de la forma esporádica de CJD. Los individuos afectados eran mucho más jóvenes que los pacientes clásicos de CJD. Normalmente , los pacientes de CJD tienen más de 63 años. Sin embargo, la media de edad de un paciente de la variante de CJD era de 28. El curso de la enfermedad en vCJD era de 13 meses en contraste con los 6 meses de la clásica CJD. En los casos de la variante, la actividad eléctrica electroencefalográfica (EEG) en el cerebro no era típica de la CJD esporádica. Aunque la patología del cerebro fue reconocida como CJD, el modelo fue diferente de la esporádica CJD, con más placas de proteína prion.

De acuerdo a SEAC, las víctimas habían comido carne de vaca o productos de carne de vaca en los últimos 10 años, indicando una relación entre CJD y BSE. Dos estudios publicados en 1997 confirmaron el supuesto de que el agente BSE es altamente probable para ser la causa de vCJD. Con este fin, un grupo de investigadores infectó tres paneles de ratones endogámicos y un panel de ratones cruzados con BSE, vCJD y CJD esporádico respectivamente. Resultados provisionales indicaron que los ratones inoculados con BSE mostraron el mismo patrón del tiempo de incubación, signos clínicos y lesiones cerebrales como los ratones inoculados con tejidos de pacientes con vCJD de lo cual se concluyó que BSE y CJD tienen la misma firma o son la misma variedad. Además, CJD esporádico y las conocidas variedades de SCARPIE no eran iguales a vCJD o BSE. Estos resultados han sido confirmados por otros investigadores para que se presente como verídico el hecho de que BSE puede ser transmitida a los seres humanos como resultado del desarrollo de vCJD.

Debido a la creciente preocupación pública y científica sobre la posibilidad de que BSE pueda ser transmitida a la población humana como resultado del consumo de productos derivados de ganado infectado se sugirió que se sacrificara el ganado que sufriera BSE y así evitar que sus restos fueran introducidos dentro de la cadena alimenticia humana. Sin embargo, dado que BSE tarda normalmente cinco o más años en manifestarse como resultado del comportamiento de un animal infectado y debido al hecho de que no ha habido ningún método rápido para asegurar la probabilidad de que una vaca esté sufriendo de BSE más que examinar el cerebro del animal sacrificado, se sugirió que la única medida que se podía adoptar, que además calmaría el miedo público a comer productos hechos con carne e vaca, era el sacrificio absoluto. Es casi inevitable que tal política diera como resultado el sacrificio de muchos cientos de reses que no estuvieran infectadas con BSE. Como consecuencia, hay una necesidad inmediata de un método que determine rápidamente BSE.

En el presente, un método disponible para determinar la presencia del agente BSE en tejidos es inocular animales, normalmente ratones, con material supuestamente infectado con BSE. Sin embargo, los estudios con la inoculación del ratón llevan mucho tiempo, en ocasiones hasta 700 días, y el fallo para identificarlo en tejidos podría indicar bien una verdadera ausencia del agente o simplemente la limitada sensibilidad de este método.

El agente responsable del desarrollo de BSE y otras enfermedades TSE, como CJD, es más pequeño que el menor virus conocido y aún no ha sido completamente descrito. Hay tres principales teorías sobre la naturaleza de este agente. (1) El agente es u n virus con características poco comunes, (2) el agente es exclusivamente una proteína de código central ("prion") que se transforma en una forma parcialmente resistente a la proteasa después de la infección , y (3) el agente es un pequeño ácido nucleico, sin ningún código y cubierto con una proteína protectora derivada del huésped. El agente BSE es extremadamente resistente al calor y a los procesos normales de esterilización. No provoca ninguna respuesta inmune detectable ni una reacción inflamatoria en los animales huésped.

Recientemente se ha descubierto que el agente responsable de la enfermedad es diferente al de los virus. El agente puede existir en múltiples formas moleculares mientras que los virus existen en una única forma con distinta morfología ultra estructural. En segundo lugar, estos agentes no son inmunológicos, a diferencia de los virus, que casi siempre provocan una respuesta inmune. En tercer lugar, no hay evidencias para confirmar la existencia de un ácido nucleico esencial en la partícula infectada, considerando que los virus tienen un genoma de ácido nucleico que sirve como platilla para la síntesis del virus progenie. Por lo tanto, finalmente se concluyó que los priones son la causa de la enfermedad degenerativa, el único componente conocido es el prion, que es codificado por un gen cromosoma del propio individuo.

Los priones infectados están básicamente compuestos de una proteína designada "isoforma scarpie" de la proteína prion, abreviada como Prpsc. Un groceso post-transacional, aún no definido, obviamente genera Prpsc de la proteína prion celular ubicua. Ambos PrP e y Prpc son codificados por una única copia del gen cromosoma y se ha demostrado que el prion inoculado inicia la producción de Prpsc del huésped normal pOlipéptido Prpc A diferencia de la forma normal, que normalmente se encuentra en la superficie celular, las isoformas se acumulan en el interior de las células en la vesícula. Las isoformas también difieren en su estructura de conformación, presentada por un mayor contenido de capa Beta que podría ser una causa de la mayor resistencia a la proteasa de la isoforma Prpsc frente a la forma normal Prpc

DE 197 41 607 revela que los polipéptidos sintéticos contienen secuencias de PrP, y propone métodos para producir anticuerpos específiCOS Prpc. El anticuer;Pc0 específiCO monoclonal15B3 producido de acuerdo al método declarado es capaz de distinguir entre Prpc y PrP e, lo que sólo se lograría empleando una digestión de la...

. Un anticuerpo unido exclusivamente a una isoforma PrP Sc de la proteína prion y que reconoce el epítopo que tiene conformación tridimensional proporcionada por la secuencia de proteínas - Cys-lIe-Thr-Gln-Tyr-Glu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr

de la isoforma prpSc de la proteína prion mientras que no se une a la forma Prpc, que se obtiene mediante un método que comprende el paso de inmunización de un animal con un peptído que consiste de la secuencia de amino ácido - Cys-lIe-Thr-Gln-Tyr-Glu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr

o -Cys-lIe-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-. 3

. El anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 1, que es un anticuerpo policlonal o monoclonal. 33

. El anticuerpo de acuerdo a cualquiera de las mencionadas reivindicaciones, que está unido a un indicador. 43 ._ El anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 1, producido por la línea celular hibridoma CNCM 1-2476. 53 . Uso del anticuerpo de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4 para la preparación de un agente para el diagnóstico de la Encefalopatía Espongiforme Bovina o Enfermedad de Creutzfeld-Jacobs o una variante de la Enfermedad Creutzfeld-Jacobs o enfermedades relacionadas con TSE. 63

. Un método de producción de un anticuerpo de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4 que comprende el paso de inmunización de un animal con una cantidad de un peptído teniendo la secuencia de aminoácido - Cys-lIe-Thr-Gln-Tyr-Glu-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr

o - Cys-lIe-Thr-Gln-Tyr-Gln-Arg-Glu-Ser-Gln-Ala-Tyr-Tyr-. ligado a través de su parte terminal N a la hemocianina de la lapa de la proteína portadora (KLH) . 73

. Conjunto de diagnósticos de BSE y/o CJD y/o vCJD o enfermedades relacionadas con TSE, que contienen un anticuerpo de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 4.

. Línea celular hibridoma capaz de producir un anticuerpo de acuerdo a la reivindicación 1. 3 ._ Línea celular hibridoma de acuerdo a la reivindicación 8, que es CNCM 1-2476.

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