Anticuerpos anti-MCP-1, composiciones, métodos y usos.

Un anticuerpo de la MCP-1 mamífero aislado, que comprende (a) al menos una región variable que comprende almenos una región variable de la cadena pesada y al menos una cadena ligera,

dicho anticuerpo de la MCP-1comprendiendo tanto las regiones variables de la cadena pesado como la cadena ligera comprendiendo las SEQ IDNOS: 27 y 28; o (b) al menos una región variable de la cadena pesada y al menos una región variable de la cadenaligera, dicho anticuerpo comprendiendo todas las secuencias de aminoácidos de la región determinantecomplementaria (CDR) de la cadena ligera y la cadena pesada de las SEQ ID NOS: 6, 7, 9, 13, 14 y 16.

Anticuerpos anti- MCP-1, composiciones, métodos y usos

Campo de la invención La presente invención se refiere a anticuerpos, incluyendo porciones o variantes especificadas, específicas para al menos una proteína o fragmento de la misma de la proteína quimioatrayente de monocitos 1 (MCP-1) , así como a anticuerpos anti-idiotipo, y ácidos nucleícos que codifican dichos anticuerpos anti-MCP-1, ácidos nucleícos complementarios, vectores, células huésped, y métodos para hacer y usar los mismos, incluyendo formulaciones terapéuticas, administración y dispositivos.

TECNICA RELACIONADA

La Proteína Quimioatrayente de Monocitos 1 (MCP-1) (también llamada CCL-2) , una proteína de 8, 6 kDA que contiene 76 residuos de aminoácidos, es un miembro de la familia quimioquina-beta (o C-C) de las citoquinas. Las quimioquinas son citoquinas de bajo peso molecular (8-10 kDa) , inducibles, secretadas, pro-inflamatorias, quimiotácticas que han demostrado jugar un papel central en la transmigración peri-vascular y la acumulación de subconjuntos específicos de leucocitos en sitios de daño tisular. Se han definido dos familias principales dependiendo del posicionamiento de cuatro cisteínas conservadas. Las CXC o a-quimioquinas atraen predominantemente neutrófilos, mientras que las CC o º-quimioquinas atraen predominantemente monocitos y otros leucocitos pero no neutrófilos (Leonard y Yoshimura y otros, 1990) . Los miembros de la familia de la proteína quimioatrayente de monocitos 1 (MCP-1) forman un componente principal de la familia C-C de quimioquinas y se consideran las quimioquinas principales implicadas en el reclutamiento de monocitos, macrófagos, y linfocitos activados. Mirando a la homología de la MCP-1 de diferentes especies, la MCP-1 humana y de mono difieren sólo en 2 aminoácidos, revelando una identidad de secuencia del 97%, mientras que la MCP-1 murina, una proteína de 13, 8 kDa que contiene 125 residuos de aminoácidos, difiere de la MCP-1 humana en el tamaño molecular y la extensión de la glicosilación.

Los receptores de la quimioquina pertenecen a la familia grande de los receptores transmembrana de siete dominios (7 TM) , acoplados a la proteína (GPCRs, también llamados receptores de serpentina) . En base a la nomenclatura de receptores establecida en la Conferencia de Investigación de Gordon de 1996 en citoquinas quimiotácticas, los receptores de quimioquina que enlazan con las quimioquinas CXC se designan CXCRs y los receptores que enlazan con las quimioquinas CC se designan CCRs.

La MCP-1 se conoce que enlaza y señala a través del receptor de quimioquina CCR2. El CCR2 es un receptor acoplado a la proteína G que abarca la transmembrana 7 expresado en muchas células incluyendo monocitos, células T, células B, y basófilos. Se han clonado dos receptores específicos de la MCP-1, el CCR2A y el CCR2B, que señalan en respuesta a concentraciones nanomolares (nM) de MCP-1. El CCR2A (CC- CKR2A) y el CCR2B (CC-CKR2A) representan dos ADNcs que codifican dos receptores específicos de MCP-1 con colas carboxilo empalmadas. La MCP-1 enlaza con ambas isoformas con alta afinidad. La MCP-1 induce el flujo de calcio en células que expresan el CCR2B pero no en células que expresan el CCR2A. 5 veces menos MCP-1 induce la quimiotaxis en células que expresan el CCR2B en comparación que células que expresan el CCR2A.

Se conocen otras proteínas con cierta homología de secuencia y funcional con la MCP-1 humana. Especialmente similar a la MCP-1 (GenBank NP_002973) son la MCP-2 (GenBank NP_005614) y la eotaxina (GenBank P_51671) ; la MCP-2 teniendo un 61, 8 por ciento y la eotaxina teniendo un 63, 2 por ciento de identidad de secuencia con la MCP-1. El rango de actividades y espectro de participación de estas proteínas en mecanismos homeostáticos humanos y patología no está tan bien entendido para los homólogos de la MCP-1. Por ejemplo, la MCP-2 (renombrada CCL8) está relacionada estrechamente con la MCP-1 y la MCP-3 (renombrada CCL7, GenBank NP_006264) y usa tanto el CCR1 como el CCR2B como sus receptores funcionales. La MCP-3 enlaza con un receptor designado D6. La MCP-3 también enlaza con el CCR10 y el CCR1. La secuencia de la proteína MCP-3 (97 aminoácidos) muestra un 74 por ciento de identidad con la MCP-1 y un 58 por ciento de homología con la MCP-2. La MCP-3 secretada difiere de la MCP-1 en que es N-glicosilada. La MCP-4 (renombrada CCL13, Genbank NP_005399) comparte un 56-61 por ciento de identidad de secuencia con las tres proteínas quimiotácticas de monocitos conocidas y es un 60 por ciento idéntica con la Eotaxina-1. Las funciones de la MCP-4 parece que son altamente similares a las de la MCP-3 y la Eotaxina. Como la MCP-3, la MCP-4 es quimioatrayente potente para los monocitos y los linfocitos T. Es inactiva en neutrófilos. En los monocitos, la MCP-4 enlaza con receptores que reconocen la MCP-1, la MCP-3, RANTES (CCL5) y la eotaxina (los receptores CCR1 y CCR3) y muestra desensibilización cruzada completa con la eotaxina-1. La MCP-5 es quimioquina CC murina y está relacionada más cercanamente con la MCP-1 humana. (66% de identidad de aminoácidos) . El símbolo de genes para la MCP-5 es SCYA12 (renombrado CCL12) . Las células transfectadas con el receptor de quimioquina CCR2 han mostrado que responden a la MCP-5. Para información general de las citoquinas y quimioquinas ver http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi y para el sistema de clasificación actual, Zlotnik A, Yoshie O. 2000. Chemokines: a new classification system and their role in immunity. Immunity 12:121-127.

La 125l-MCP-1 enlaza con monocitos y el análisis del gráfico de Scatchard indicó que los monocitos tenían un mínimo de 1700 sitios de enlace por célula con una Kd de -2 nM (Yoshimura y Leonard, 1990) . Los experimentos de enlace en equilibrio posteriores con monocitos humanos revelan la presencia de aproximadamente 3000 sitios de enlace por célula con una Kd de 0.77 nM (Ernst y otros, 1994) . La 125l-MCP-1 también demostró alta afinidad de enlace con las células dEoL-3 que expresan el receptor CCR2 con un valor de Kd de 0, 4 nM (Sarau y otros, 1997) confirmando la afinidad sub-nanomolar de la MCP-1 a su receptor. Para identificar las regiones de la MCP-1 que contactan con su receptor, CCR2, todos los residuos expuestos en la superficie se sustituyeron con alanina. Algunos residuos fueron también mutados a otros aminoácidos para identificar la importancia de la carga, hidrofobicidad, o aromaticidad en las posiciones específicas. Dos agrupaciones de residuos principalmente básicos (R24, K35, K38, K49 y Y13) separados por una ranura hidrofóbica 35 A, redujeron el nivel de enlace en 15- 100- veces. Los datos sugieren un modelo en el que un área de superficie grande de MCP-1 contacta con el receptor, la acumulación de un número de interacciones débiles resulta en la afinidad 35 pM observada en la proteína de tipo salvaje (WT) (Hemmerich y otros, 1999) . El rango de afinidades desde 2 nM hasta 35 pM en la bibliografía se puede deber a los ensayos usados y las limitaciones de los ensayos respectivas.

Se conocen otras proteínas con cierta homología funcional y de secuencia con la MCP-1 humana. Especialmente similares a la MCP-1 (GenBank NP_002973) son la MCP-2 (GenBank NP_005614) y la eotaxina (GenBank P_51671) ; la MCP-2 teniendo un 61, 8 por ciento y la eotaxina-1 teniendo un 63, 2 por ciento de identidad de secuencia con la MCP-1. El rango de actividades y espectro de participación de estas proteínas en mecanismos homeostáticos y patología humanos no se entiende claramente para estos homólogos de la MCP-1. Por ejemplo, la MCP-2 está relacionada estrechamente con la MCP-1 y la MCP-3 (Genbank NP_006264) y usa tanto el CCR1 como la CCR2B como sus receptores funcionales. La MCP-3 enlaza con un receptor designado D6. La MCP-3 también enlaza con la CCR10. La secuencia de la proteína MCP-3 (97 aminoácidos) muestra un 74 por ciento de identidad con la MCP-1 y un 58 por ciento de homología con la MCP-2. La MCP-3 secretada difiere de la MCP-1 en que es Nglicosilada. La MCP-4 (Genbank NP_005399) comparte un 56-61 por ciento de identidad de secuencia con las tres proteínas quimiotácticas de monocitos conocidas y es un 60 por ciento idéntica con la Eotaxina 1. Las funciones de la MCP-4 parecen ser altamente similares a las de la MCP-3 y la Eotaxina. Como la MCP-3, la MCP-4 es un quimioatrayente potente para los monocitos y los linfocitos T. Es inactiva en los neutrófilos. En los monocitos la MCP-4 enlaza con receptores que reconocen la MCP-1, la MCP-3 y la RANTES (CCR2) . En eosinófilos, la MCP-4 tienen una potencia y eficacia similares a la MCP-3, RANTES y Eotaxina. La MCP-4 comparte receptores con la eotaxina (CCR1 y CCR3) y muestra desensibilización cruzada completa con la eotaxina-1.

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1. Un anticuerpo de la MCP-1 mamífero aislado, que comprende (a) al menos una región variable que comprende al menos una región variable de la cadena pesada y al menos una cadena ligera, dicho anticuerpo de la MCP-1 comprendiendo tanto las regiones variables de la cadena pesado como la cadena ligera comprendiendo las SEQ ID NOS: 27 y 28; o (b) al menos una región variable de la cadena pesada y al menos una región variable de la cadena ligera, dicho anticuerpo comprendiendo todas las secuencias de aminoácidos de la región determinante complementaria (CDR) de la cadena ligera y la cadena pesada de las SEQ ID NOS: 6, 7, 9, 13, 14 y 16.

2. Un anticuerpo de la MCP-1 de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el mencionado anticuerpo enlaza con la MCP-1 con una afinidad de al menos una seleccionada de al menos 10-9M, al menos 10-10M, al menos 10-11M, o al menos 10-12M.

3. Un anticuerpo de la MCP-1 de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde dicho anticuerpo modula sustancialmente al menos una actividad de al menos un polipéptido de la MCP-1 seleccionada de enlace de la MCP-1 al receptor en las superficies celulares, la internalización del receptor de CCR2 y la movilización de Ca2+ estimulada por MCP-1.

4. Un ácido nucleíco aislado que codifica al menos un anticuerpo de la MCP-1 mamífero aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

5. Un vector de ácido nucleíco aislado que comprende un ácido nucleíco asilado de acuerdo con la reivindicación 4.

6. Una célula huésped procariota o eucariota que comprende un ácido nucleíco aislado de acuerdo con la reivindicación 5.

7. Una célula huésped de acuerdo con la reivindicación 6, en donde dicha célula huésped es al menos una seleccionada de COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, YB2/0, células de mieloma, o linfoma, o cualquier célula derivada, inmortalizada o transformada de las mismas.

8. Un método no terapéutico para producir al menos un anticuerpo de la MCP-1, que comprende traducir un ácido nucleíco de acuerdo con la reivindicación 5 bajo condiciones in vitro, in vivo o in situ, de tal forma que el anticuerpo de la MCP-1 sea expresado en cantidades detectables o recuperables, en donde el método no se realiza en un humano.

9. Una composición que comprende al menos un anticuerpo de la MCP-1 mamífero aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 que tiene al menos una CDR humana, y al menos un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable.

10. Una composición de acuerdo con la reivindicación 9, comprendiendo además al menos un compuesto o polipéptido seleccionado de al menos uno de un etiqueta o indicador detectable, un antagonista TNF, un fármaco anti-infeccioso, un fármaco del sistema cardiovascular (CV) , un fármaco del sistema nervioso central (CNS) , un fármaco del sistema nervioso autónomo (ANS) , un fármaco del tracto respiratorio, un fármaco del tracto gastrointestinal (GI) , un fármaco hormonal, un fármaco para el equilibrio de fluidos o electrolitos, un fármaco hematológico, un antineoplásico, un fármaco para la inmunomodulación, un fármaco oftálmico, nasal u ótico, un fármaco tópico, un producto nutricional, una citocina o un antagonista de citocina.

11. Un anticuerpo o fragmento anti-idiotipo que enlaza específicamente con al menos un anticuerpo de la MCP-1 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

12. Un anticuerpo de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 para diagnosticar o tratar una condición relacionada con la MCP-1 en una célula, tejido, órgano o animal.

13. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicho anticuerpo es para ser administrado en una cantidad efectiva de 0, 001-50 mg/kilogramo de dichas células, tejido, órgano o animal.

14. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicho anticuerpo es para ser administrado por al menos un modo seleccionado de parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitario, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocardiaco, intraóseo, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarectal, intrarenal, intraretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, intralesional, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmico.

15. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 12, en donde dicho anticuerpo es para ser administrado antes, concurrentemente o después de al menos una composición que comprende una cantidad efectiva de al menos un compuesto o polipéptido seleccionado de al menos uno de una etiqueta o indicador detectable, un fármaco antiinfeccioso, un fármaco del sistema cardiovascular (CV) , un fármaco del sistema nervioso central (CNS) , un fármaco del sistema nervioso autónomo (ANS) , un fármaco del tracto respiratorio, un fármaco del tracto gastrointestinal (GI) , un fármaco hormonal, un fármaco para el equilibrio de fluidos o electrolitos, un fármaco hematológico, un antineoplásico, un fármaco para la inmunomodulación, un fármaco oftálmico, nasal u ótico, un fármaco tópico, un producto nutricional, una citocina o un antagonista de citocina.

16. Un dispositivo médico, que comprende al menos un anticuerpo de la MCP-1 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3 en donde dicho dispositivo es adecuado para poner en contacto o administrar el mencionado al menos un anticuerpo de la MCP-1 por al menos un modo seleccionado de parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitario, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocardiaco, intraóseo, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarectal, intrarenal, intraretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, intralesional, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmico.

17. Un artículo de fabricación para el uso farmacéutico o de diagnóstico humano, que comprende material de envasado y un recipiente que comprende una solución o una forma liofilizada de al menos un anticuerpo de la MCP1 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3.

18. El artículo de fabricación de la reivindicación 17, en donde el mencionado recipiente es un componente para un dispositivo o sistema de administración parenteral, subcutáneo, intramuscular, intravenoso, intraarticular, intrabronquial, intraabdominal, intracapsular, intracartilaginoso, intracavitario, intracelial, intracerebelar, intracerebroventricular, intracólico, intracervical, intragástrico, intrahepático, intramiocardiaco, intraóseo, intrapélvico, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrarectal, intrarenal, intraretinal, intraespinal, intrasinovial, intratorácico, intrauterino, intravesical, intralesional, bolo, vaginal, rectal, bucal, sublingual, intranasal o transdérmico.

19. Un método para producir al menos un anticuerpo de la MCP-1 mamífero aislado de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que comprende proporcionar una célula huésped o animal transgénico no humano o planta

o célula vegetal transgénica capaz de expresar en cantidades recuperables dicho anticuerpo.