Análogos de péptidos de unión a HLA sintéticos y sus usos.

Un péptido sintético que comprende una secuencia de aminoácidos que es un péptido análogo de un péptidonativo que se une de modo específico a una molécula HLA A0201 sobre una célula característica de un estadopatofisiológico en un mamífero,

en el que la secuencia de aminoácidos del péptido análogo es YMFPNAPYL (SEQID NO:18), y la secuencia de aminoácidos del péptido nativo es RMFPNAPYL ( SEQ ID NO:17).

Análogos de péptidos de unión a HLA sintéticos y sus usos.

Antecedentes de la invención Campo de la invención La presente invención se refiere al campo de la inmunología y la terapia de la leucemia. De forma más específica, esta invención se refiere a péptidos análogos sintéticos, según se definen en la reivindicación 1, que pueden inducir respuestas de células T humanas heteroclíticas contra péptidos nativos de los análogos sintéticos.

Descripción de la técnica relacionada La leucemia mielógena crónica (CML) es un trastorno de las células precursoras pluripotenciales que se caracteriza por la presencia del cromosoma Filadelfia (Ph) . El cromosoma Filadelfia representa una translocación en la que el oncogén c-abl se ha movido desde el cromosoma 9 a la región de agrupamiento de los puntos de corte (bcr) dentro del gen bcr en el cromosoma 22, que produce un gen bcr-abl quimérico. Los genes fusionados codifican un ARNm quimérico de 8, 5 kb que normalmente se traduce en una proteína de 210 kDa o 190 kDa. Esta proteína bcr-abl es una tirosina quinasa que está presente exclusivamente en las células de leucemia de pacientes con leucemia mielógena crónica, y es necesaria y suficiente para la transformación.

En la leucemia mielógena crónica, el punto de corte en el gen bcr aparece entre el exón 2 (b2) y 3 (b3) de bcr, o entre el exón 3 (b3) y 4 (b4) de bcr. Aunque pueden aparecer genes de fusión bcr-abl y un corte y empalme del ARNm de bcr-abl aberrantes, la mayoría de los pacientes con leucemia mielógena crónica expresan, por tanto, p210-b3a2 o p210-b2a2; a menudo ambas proteínas p210 y p190 se expresan junto con niveles bajos de proteínas bcr-abl p190-e1a2. En la leucemia linfocítica aguda Ph1-positiva (ALL) , el punto de corte predominante está en el sitio e1a2.

Las proteínas de fusión quiméricas son antígenos potenciales. En primer lugar, las proteínas se expresan exclusivamente en células de leucemia mielógena crónica en las que las regiones de junturas contienen una secuencia de aminoácidos que no se expresa en ninguna proteína normal. En segundo lugar, como resultado de la división de codones en el mensaje condensado, un nuevo aminoácido, lisina en b3a2, y un aminoácido conservado, ácido glutámico en b2a2, están presentes en el punto de fusión exacto en cada una de las proteínas. Por tanto, las secuencias de aminoácidos exclusivas que incluyen la región del punto de corte b3a2 y b2a2 pueden considerarse verdaderamente antígenos específicos de tumor. A pesar de la localización intracelular de estas proteínas, pueden presentarse sobre la superficie celular péptidos cortos producidos mediante el procesamiento celular de los productos de las proteínas de fusión, dentro de la hendidura de las moléculas de HLA y en esta forma puede ser reconocidos por las células T.

Recientes ensayos clínicos han demostrado que una vacuna multivalente derivada de bcr-abl específica de tumor puede administrarse de modo seguro a pacientes con leucemia mielógena crónica en fase crónica. La vacuna provoca de forma fiable una respuesta inmunológica de CD4 específica del péptido de bcr-abl, según se mide mediante DTH in vivo, mediante la proliferación de células T CD4+ ex vivo, y mediante la secreción de interferóngamma en un ensayo ELISPOT. Sin embargo, no se detectaron respuestas de CD8 en pacientes HLA A0201 y sólo se detectaron respuestas débiles en pacientes HLA A0301 utilizando un ensayo ELISPOT de interferón-gamma sensible.

La proteína tumoral de Wilms 1 (WT1) es un factor de la transcripción de dedo de cinc expresado durante la ontogénesis normal, tal como en el riñón, el testículo y el ovario fetales. En adultos, la expresión de WT1 está limitada a unos niveles bajos en células precursoras hematopoyéticas, células progenitoras mioepiteliales, podocitos renales y algunas células en testículos y ovarios. La reciente demostración de que WT1 se sobreexpresa en varios tipos de leucemia sugiere que WT1 sería una diana atractiva para la inmunoterapia. Se han identificado tres nonámeros peptídicos a partir de WT1 que generan una respuesta citotóxica específica de WT1 en el contecto de HLA 0201 y HLA 2402. Sin embargo, puesto que la proteína WT1 es un autoantígeno, la tolerancia a la rotura es un problema potencial.

Para la estimulación de respuestas, la potencia de las respuestas CD8 depende de la afinidad de unión del péptido diana a moléculas MHC de clase I, la estabilidad del complejo de péptido-HLA, y la avidez de la unión del receptor de células T por el complejo del péptido. La destrucción de las células de CML nativas también requiere un procesamiento y presentación adecuados del antígeno natural. Por tanto, la falta de respuestas CD8 reproducibles en estos ensayos clínicos podría ser el resultado de la bioquímica de estas interacciones de HLA-péptido de clase I, que dan como resultado su débil inmunogenicidad frente a células CD8 citotóxicas. No se indicado que ninguno de los péptidos CML nativos se una a MHC humano unido al bolsillo de HLA con alta afinidad. Esto puede explicar, en parte, la falta de respuesta inmunológica detectable frente a péptidos de bcr-abl como proteínas que se observa en pacientes con leucemia mielógena aguda, a pesar de la aparición de este antígeno en las células de CML.

En algunos sistémas antigénicos se emplean análogos de péptidos para evitar una mala respuesta inmunológica. Se ha descubierto una alta correlación entre las afinidades globales de los análogos de péptidos por moléculas de MHC de clase I y la inmunogenicidad de péptidos in vivo en ratones transgénicos HLA-A2Kb. Se ha indicado una correlación mejor entre la capacidad de un péptido para formar complejos HLA-A0201 estables y la inmunogenicidad. También se ha indicado una mejor inmunogenicidad en ratones trangénicos HLA-A0201/Kb para los análogos de un autopéptido, gp100154-162, que muestra una afinidad mayor y un estabilidad del complejo más prolongada que el péptido natural.

Para diseñar análogos de péptidos se han empleado con éxito varios algoritmos en los que secuencias grandes de proteínas son exploradas para detectar la presencia de motivos de unión adecuados, lo cual ha conducido a la identificación de antígenos predichos que después se han validado de modo experimental. Se han formulado análogos de péptidos antigénicos mediante modificaciones directas de posiciones de anclaje de MHC, que se denominan “ligandos con anclaje a MHC modificado”, o modificaciones de los sitios de contacto de TCR, que se denominan en general “ligandos peptídicos alterados”. Se cree que la identificación de análogos de epitopo peptídicos que refuercen la estabilidad del complejo de MHC-péptido in vivo e in vitro aumentará la potencia de péptidos inmunogénicos intrínsicamente débiles para la activación y la amplificación de subconjuntos de células T pertinentes. Este concepto fue descrito por primera vez en un modelo de células T CD4+ murino empleando péptidos del VIH (1) , y ahora se ha extendido a una diversidad de sistemas inmunológicos víricos y tumorales.

Se han diseñado variantes artificiales de autopéptidos de unión a MHC de clase I (2) . Puesto que estos variantes peptídicos son extraños para el sistema inmunológico del hospedante, se induce una fuerte respuesta de CTL. A diferencia de las respuestas débiles de células T a los complejos de autopéptido-MHC, las respuestas de CTL a los péptidos variantes pueden mantenerse durante un periodo más largo sin provocar la aniquilación de los clones debido a que no hay señales suficientes para la división o la supervivencia celular. Puesto que una fracción sustancial de dichos CTL presenta reacción cruzada con autopéptidos no mutados expresados en células tumorales en cantidades mucho más pequeñas, la inmunización con péptidos variantes puede ser un método más eficaz para inducir CTL contra tumores. El sistema de puntuación para los péptidos de unión a MHC de clase I debería proporcionar un método conveniente para el diseño de péptidos de autoimitación que presenten reacción cruzada para la inmunización.

La mayor inmunogenicidad in vivo y la importancia de los ligandos con anclaje a MHC modificado se demostró formalmente por primera vez en una enfermedad neoplásica humana en un estudio controlado de pacientes con melanoma maligno utilizando un péptido restringido A0201 asociado a melanoma derivado de gp100. En fechas recientes se ha demostrado, con métodos de detección basados en HLA-tetrámero, que los péptidos antigénicos Melan-A originales son agonistas débiles que activan células específicas de antígeno de modo subóptimo (3) . En contraste, se han identificado análogos... [Seguir leyendo]

1. Un péptido sintético que comprende una secuencia de aminoácidos que es un péptido análogo de un péptido nativo que se une de modo específico a una molécula HLA A0201 sobre una célula característica de un estado patofisiológico en un mamífero, en el que la secuencia de aminoácidos del péptido análogo es YMFPNAPYL (SEQ ID NO:18) , y la secuencia de aminoácidos del péptido nativo es RMFPNAPYL (SEQ ID NO:17) .

2. El péptido sintético de la reivindicación 1, en el que dicho péptido sintético se une a dicha molécula HLA A0201 con mayor afinidad que dicho péptido nativo.

3. El péptido sintético de la reivindicación 1 o 2, en el que dicho péptido análogo es un producto de la degradación del procesamiento de dicho péptido sintético.

4. El péptido sintético de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho péptido sintético es capaz de inducir la formación y la proliferación de células T citotóxicas humanas que presentan reacción cruzada con células humanas que presentan dicho péptido nativo.

5. El péptido sintético de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho estado patofisiológico, trastorno o enfermedad es el cáncer.

6. Una composición inmunogénica que comprende:

(a) el péptido sintético de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o una molécula de ADN que lo codifica; y

(b) un adyuvante.

7. La composición inmunogénica de la reivindicación 6, en la que dicho adyuvante es adyuvante de Freund, fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio, alumbre, QS21 o BCG.

8. La composición inmunogénica de la reivindicación 6 o 7, que comprende además un vehículo inmunogénico unido a dicho péptido sintético.

9. La composición inmunogénica de la reivindicación 8, en la que dicho vehículo inmunogénico es una proteína, un péptido, o una célula presentadora de antígenos.

10. La composición inmunogénica de la reivindicación 9, en la que dicha proteína o péptido es hemocianina de lapa, albúmina, o un poliaminoácido.

11. La composición inmunogénica de la reivindicación 9, en la que dicha célula presentadora de antígenos es una célula dendrítica.

12. Un método in vitro para inducir la formación y la proliferación de células T citotóxicas humanas que producen una respuesta inmunológica heteroclítica contra células cancerosas, que comprende:

poner en contacto células inmunológicas humanas in vitro con el péptido sintético de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o la composición inmunogénica de las reivindicaciones 6-11, para activar dichas células inmunológicas; e inducir la formación y la proliferación de dichas células T citotóxicas humanas reactivas contra las células que presentan dicho péptido sintético, en el que dichas células T en proliferación presentarán reacción cruzada con las células cancerosas que presentan un péptido nativo del cual se deriva dicho segmento de análogo, de modo que dichas células T citotóxicas humanas son capaces de producir una respuesta inmunológica heteroclítica contra las células cancerosas.

13. El péptido sintético de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o la composición inmunogénica de las reivindicaciones 6-11, para su uso en el tratamiento del cáncer mediante la inducción de la formación y la proliferación de células T citotóxicas humanas que producen una respuesta inmunológica heteroclítica contra células cancerosas, que comprende:

poner en contacto células inmunológicas humanas in vivo con el péptido sintético de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o la composición inmunogénica de las reivindicaciones 6-11, para activar dichas células inmunológicas; e inducir la formación y la proliferación de dichas células T citotóxicas humanas reactivas contra las células que presentan dicho péptido sintético, en el que dichas células T en proliferación presentarán reacción cruzada con las células cancerosas que presentan un péptido nativo del cual se deriva dicho segmento de análogo, de modo que dichas células T citotóxicas humanas son capaces de producir una respuesta inmunológica heteroclítica contra las células cancerosas.

14. El péptido sintético o la composición inmunogénica de la reivindicación 13 para su uso en el tratamiento de la reivindicación 13, en el que dichas células inmunológicas se ponen en contacto in vivo con un individuo que padece cáncer.

15. El péptido sintético o la composición inmunogénica de la reivindicación 13 para su uso en el tratamiento de la reivindicación 13, en el que dichas células inmunológicas se ponen en contacto in vivo con un donante, comprendiendo además dicho método:

obtener dichas células T citotóxicas del donante; e infusionar dichas células T citotóxicas en un individuo que padece cáncer.

16. El péptido sintético de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o la composición inmunogénica de las reivindicaciones 6-11, para su uso en el tratamiento del cáncer mediante la inducción de la formación y la proliferación de células T citotóxicas humanas que producen una respuesta inmunológica heteroclítica contra células cancerosas, que comprende:

poner en contacto células inmunológicas humanas de un paciente o donante sano ex vivo con el péptido sintético de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o la composición inmunogénica de las reivindicaciones 6-11, para activar dichas células inmunológicas;

infusionar dichas células inmunológicas activadas en un individuo que padece cáncer; e inducir la formación y la proliferación de dichas células T citotóxicas humanas reactivas contra las células que presentan dicho péptido sintético, en el que dichas células T en proliferación presentarán reacción cruzada con las células cancerosas que presentan un péptido nativo del cual se deriva dicho segmento de análogo, de modo que dichas células T citotóxicas humanas son capaces de producir una respuesta inmunológica heteroclítica contra las células cancerosas.

17. El péptido sintético o la composición inmunogénica de una cualquiera de las reivindicaciones 13-16 para su uso en el tratamiento de las reivindicaciones 13-16, en el que dicho cáncer está activo o en remisión.