ANÁLISIS INFRARROJO DE FRACCIONES DE SANGRE PERIFÉRICA OBTENIDA PARA INDICAR DESARROLLO COGNITIVO ASOCIADO A LA ENFERMEDAD DE ALZHEIMER.

Análisis infrarrojo de fracciones de sangre periférica obtenida para indicar desarrollo cognitivo asociado a la enfermedad de Alzheimer.

La presente invención se refiere a un método de análisis espectroscópico infrarrojo de transmisión para determinar el grado de deterioro global cognitivo asociado a la enfermedad de Alzheimer basado en analizar la región 3100-1300 cm-1 del espectro de infrarrojo de una muestra de sangre previamente obtenida y fraccionada. Preferentemente, la muestra de sangre fraccionada a analizar es una fracción de leucocitos.

Asimismo, es también objeto de la presente invención el empleo de dicho método para obtener una indicación de una condición de enfermedad de Alzheimer y/o una indicación del grado de deterioro cognitivo asociado a dicha enfermedad.

Analisis infrarrojo de fracciones de sangre periferica obtenida para indicar desarrollo cognitivo asociado a la enfermedad de alzheimer

SECTOR DE LA TÉCNICA

La invención se refiere a un nuevo método de determinación de estructura proteica de lámina- en leucocitos de sangre periférica obtenida mediante espectroscopía infrarroja de transmisión, y el sector principal de aplicación es el de la salud, y puede interesar también al sector comercial de la instrumentación espectroscópica infrarroja. Más concretamente, la invención se refiere a un método indicativo de la presencia o ausencia de la enfermedad de Alzheimer (EA) y/o su grado de desarrollo, basado en la espectroscopía infrarroja de transmisión.

ESTADO DE LA TÉCNICA

En los próximos 50 años se espera que la enfermedad de Alzheimer (EA) afecte a 100 millones de personas en el mundo. Es de sobra conocido que las características patofisiológicas más importantes de la enfermedad de Alzheimer son las placas seniles y los ovillos neurofibrilares. El componente mayoritario de dichas placas es el péptido -amiloide (A) . Este péptido de 39-43 aminoácidos es muy hidrofóbico, se libera en la escisión proteolítica de la proteína precursora amiloidea (APP) , y se agrega para formar oligómeros. Estos oligómeros a su vez se agregan para formar fibras, que se depositan en el parénquima cerebral y originan las placas seniles (Haass 2004) . Los efectos neurotóxicos del péptido A implican también cambios en la composición y estructura de las membranas neuronales, afectando a sus propiedades fisicoquímicas. Uno de los mayores retos respecto a esta enfermedad neurodegenerativa reside en la consecución de un método de diagnóstico precoz con vistas a la administración de un tratamiento adecuado. En la actualidad el diagnóstico definitivo más eficaz está limitado a un examen post-mortem, y el diagnóstico clínico se hace por exclusión tras estudiar el especialista si existe una demencia y no encontrar ningún síntoma o signo que explique la causa de la misma. Los métodos inmunoquímicos que utilizan anticuerpos, como se sabe son laboriosos y además no tienen una sensibilidad del 100% debido a la posible existencia de varias isoformas estructurales de los biomarcadores. Muchos son los problemas que plantea esta enfermedad, entre ellos el diagnóstico precoz y el seguimiento de la evolución de los enfermos, así como el diagnóstico definitivo post-mortem y la caracterización de los cambios neuropatológicos. Todos ellos requieren desarrollo de métodos sensibles y fiables, fáciles de realizar y repetir, y de bajo costo.

En relación con ello la espectroscopía infrarroja es una técnica bien establecida en los ámbitos industriales y de la investigación científica desde hace varias décadas. Sus ventajas frente a otras técnicas usuales son:

a. Se pueden analizar muestras en cualquier estado físico con una preparación sencilla y relativamente rápida, a diferencia de otras técnicas analíticas.

b. Se precisan cantidades de muestra relativamente pequeñas.

Recientemente se ha aplicado esta técnica espectroscópica al análisis de fluido cerebroespinal para el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer (Griebe y cols. 2007) , con sensibilidad y especificidad de aproximadamente 85 y 75% respectivamente. Sin embargo, la extracción de este fluido biológico no es tan fácil de realizar como una extracción sanguínea, aparte de las connotaciones psicológicas de la extracción de fluido cerebroespinal. La espectroscopía infrarroja se ha aplicado asimismo al análisis de tejido cerebral obtenido de pacientes con la enfermedad de Alzheimer (Rak y cols., 2007; Choo y cols., 1996; Fabian y cols., 1993) , obteniéndose espectros con bandas características de péptidos amiloides situadas en el intervalo espectral de 16351624 cm-1. No aparecen por tanto en la literatura trabajos de investigación en los que se aplique la espectroscopía infrarroja al análisis de componentes o fracciones de la sangre como criterio de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer. Por la posibilidad que tiene esta técnica de determinar la composición y estructura de componentes celulares y acelulares de la sangre, que es un fluido biológico de fácil extracción, y poseer las ventajas mencionadas anteriormente sobre otras técnicas, se ha aplicado en esta invención como método de diagnóstico de esta enfermedad.

Bibliografía

1. Choo, L.P.; Wetzel, D.L.; Halladay, W.C.; Jackson, M.; LeVine, S.M.; Mantsch, H.H. In situ characterization of amyloid in Alzheimer’s diseased tissue by synchrotron Fourier transform infrared microspectroscopy. Biophysical Journal 71, 1672-1679 (1996) .

2. Fabian, H.; Choo, L.P.; Szendrei, G.I.; Jackson, M.; Halladay, W.C.; Otvos, L., J.; Mantsch, H.H. Infrared spectroscopic characterization of Alzheimer plaques. Applied Spectroscopy 47, 1513-1518 (1993) .

3. Griebe, M.; Daffertshofer, M.; Stroick, M.; Syren, M.; Ahmad-Nejad, P.; Neumaier, M.; Backhaus, J.; Hennerici, M.G.; Fatar, M. Infrared spectroscopy: A new diagnostic tool in Alzheimer disease. Neuroscience Letters 420, 29-33 (2007) .

4. Haass, C. Take five-Bace and the -secretase quartet conduct Alzheimer’s amyloid -peptide generation. EMBO Journal. 23, 483-488 (2004) .

5. Rak, M.; Del Bigio, M.R.; Mai, S.; Westaway, D.; Gough, K. Dense-core and diffuse AA plaques in TgCRND8 mice studied with synchrotron FTIR microspectroscopy. Biopolymers 78, 207-217 (2007) .

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Breve Descripción de la Invención La presente invención se refiere a un método de aplicación de la espectroscopía infrarroja de transmisión al análisis de muestras de sangre obtenida, preferentemente sangre periférica humana obtenida, para determinar el deterioro global cognitivo asociado a la enfermedad de Alzheimer, y por tanto, para su aplicación en el diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer. El método requiere un fraccionamiento previo de muestras de sangre obtenida, que se recogen en tubos BD Vacutainer CPT con citrato sódico y se someten a centrifugación-filtración.

De la suspensión acuosa leucocitaria se depositan varios microlitros sobre un cristal por ejemplo de seleniuro de cinc, soporte de muestras para espectroscopía infrarroja, con el fin de obtener una película de estas células y medir su correspondiente espectro. También se pueden utilizar otros soportes de muestras insolubles en agua tales como fluoruro cálcico, sulfuro de cinc, fluoruro bárico. El espectro medido se trata matemáticamente para determinar la correspondiente concentración de estructura proteica en lámina-, que está asociada a la EA, y someterlo además a análisis estadístico multivariante (PLS) . Por razones de sensibilidad la determinación de la referida estructura proteica se ha realizado mediante los espectros infrarrojos expresados en segundas derivadas. El análisis PLS está basado en correlacionar el parámetro o escala que define los diferentes estadios de la enfermedad de Alzheimer (escala de deterioro global, GDS) con regiones espectrales que tienen relación con esta enfermedad, a saber, la región amida I (1700-1600 cm-1) , amida II (1600-1500 cm-1) , la comprendida entre 1500-1300 cm-1 (que incluye bandas de deformación angular C-H y de tensión de grupos carboxilato) y la de tensión C-H comprendida entre 3100 y 2800 cm-1. Finalmente se mide el porcentaje de predicción en muestras de controles sanos y de pacientes para obtener la sensibilidad y especificidad del método. Un conocimiento más detallado de la invención se adquiere a continuación, donde se describen algunas figuras y ejemplos ilustrativos.

Descripción Detallada de la Invención La presente invención se basa en que los autores han observado, por una parte, que la estructura proteica en lámina- es más abundante en leucocitos obtenidos de pacientes con la EA que de controles y, por otra parte, que existe cierta correlación entre la escala de deterioro global (GDS) de esta enfermedad y los perfiles espectrales de las regiones amida I (1700-1600 cm-1) , amida II (1600-1500 cm-1) , la comprendida entre 1500-1300 cm-1 (que incluye bandas de deformación angular C-H y de tensión de grupos carboxilato) y la de tensión C-H comprendida entre 3100 y 2800 cm-1.

En el ámbito de la presente invención, la escala de deterioro global cognitivo (también referida en esta memoria como GDS) se refiere a la escala de deterioro global definida por Reisberg para describir detalladamente los estadios de la evolución de la enfermedad de Alzheimer. Dicha escala se compone de siete niveles, y en el ámbito de la presente invención se definen como:

- GDS-1: que corresponde a un individuo normal sin déficit cognitivo... [Seguir leyendo]

1. Método espectroscópico infrarrojo para determinar deterioro global cognitivo asociado a la enfermedad de Alzheimer caracterizado porque comprende las siguientes etapas:

a. registrar un espectro infrarrojo de transmisión a una primera muestra de sangre obtenida;

b. obtener al menos un primer parámetro numérico a partir de al menos una señal del espectro de la región comprendida entre 3100 y 1300 cm-1, incluidos ambos límites;

c. comparar dicho al menos primer parámetro numérico de la etapa 1b con al menos un segundo parámetro numérico de referencia;

d. determinar a partir de la comparación de la etapa anterior si la muestra de sangre de la etapa 1a corresponde a una clase definida por:

I. no deterioro cognitivo asociado a la enfermedad de Alzheimer,

II. deterioro cognitivo asociado a la enfermedad de Alzheimer;

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque la primera muestra de sangre obtenida es una muestra obtenida de sangre periférica humana.

3. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizado porque la primera muestra de sangre es una muestra de una fracción de sangre obtenida seleccionada entre una fracción celular y una fracción acelular.

4. Método según la reivindicación 3, caracterizado porque la fracción de sangre obtenida es una fracción de leucocitos de sangre periférica humana.

5. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 3 ó 4, caracterizado porque la muestra de una fracción de sangre obtenida se prepara siguiendo un procedimiento que comprende:

a. preparar una suspensión acuosa de una fracción de sangre obtenida por centrifugación-filtración,

b. depositar y extender sobre un cristal de seleniuro de cinc para espectroscopía infrarroja un volumen de la anterior suspensión acuosa comprendido entre 5 y 125 µL, incluidos ambos límites,

c. evaporar completamente la suspensión depositada a temperaturas comprendidas entre 2 y 20 ºC, incluidos ambos límites,

6. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho primer parámetro numérico es un porcentaje del contenido de estructura β peptídica de la muestra de sangre obtenida.

7. Método según la reivindicación 6, caracterizado porque el porcentaje del contenido de estructura β peptídica se obtiene por un procedimiento que comprende:

a. expresar en segunda derivada en el dominio de frecuencias una región del espectro de infrarrojo comprendida entre 1700 y 1600 cm-1, incluidos ambos límites;

b. identificar cada una de las bandas asociadas a estructura β peptídica en la región del espectro infrarrojo comprendida entre 1640 y 1620 cm-1, incluidos ambos límites;

c. calcular el porcentaje de estructura β peptídica multiplicando por cien la suma de las áreas de cada una de las bandas asociadas a estructura de tipo peptídica en la región del espectro infrarrojo comprendida entre 1639 y 1623 cm-1, incluidos ambos límites, y dividiendo por el área total de dicho espectro en la región comprendida entre 1680 y 1623 cm-1, incluidos ambos límites.

8. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 6 ó 7, caracterizado porque el porcentaje del contenido de estructura β peptídica del espectro infrarrojo clasifica la primera muestra de sangre obtenida según la siguiente relación:

a. muestra de sangre correspondiente a una clase I si el porcentaje del contenido de estructura β peptídica es igual o inferior al 12%;

b. muestra de sangre correspondiente a una clase II si el porcentaje del contenido de estructura β es superior al 12%;

9. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el al menos segundo parámetro numérico de referencia se obtiene en las mismas condiciones que el primer parámetro de la etapa 1b, a partir de un segundo espectro de infrarrojo registrado en al menos una segunda muestra de sangre de referencia obtenida de cada una de las clases definidas en I y II.

10. Método según la reivindicación 9, caracterizado porque :

a. la clase I de dicha segunda muestra de sangre obtenida de referencia comprende al menos la subclase definida por:

I-a. no deterioro cognitivo asociado a la enfermedad de Alzheimer con un valor de GDS-1 en la escala de deterioro global cognitivo de Reisberg,

b. la clase II de dicha segunda muestra de sangre de referencia comprende al menos las subclases definidas por:

II-a. deterioro cognitivo leve asociado a la enfermedad de Alzheimer con un valor de GDS-3 en la escala de deterioro global cognitivo de Reisberg,

II-b. deterioro cognitivo moderado asociado a la enfermedad de Alzheimer con un valor de GDS-4 en la escala de deterioro global cognitivo de Reisberg,

II-c. deterioro cognitivo moderadamente grave asociado a la enfermedad de Alzheimer con un valor de GDS-5 en la escala de deterioro global cognitivo de Reisberg,

II-d. deterioro cognitivo grave asociado a la enfermedad de Alzheimer con un valor de GDS-6 en la escala de deterioro global cognitivo de Reisberg,

II-e. deterioro cognitivo muy grave asociado a la enfermedad de Alzheimer con un valor de GDS-7 en la escala de deterioro global cognitivo de Reisberg.

11. Método según la reivindicación 10, caracterizado porque dicho primer parámetro numérico son los valores de las absorbancias de cada una de las frecuencias de las regiones comprendidas entre 1500-1300 cm-1, 16001500 cm-1, 1700-1600 cm-1, y 3100-2800 cm-1 del espectro de la primera muestra de sangre, y dicho segundo parámetro numérico de referencia de cada una de las clases definidas en I-a, II-a, II-b, II-c, II-d y II-e son los valores de las absorbancias de cada una de las frecuencias de las regiones comprendidas entre 1500-1300 cm-1, 1600-1500 cm-1, 1700-1600 cm-1, y 3100-2800 cm-1 del espectro de cada muestra de sangre de referencia.

12. Método según la reivindicación 11, caracterizado porque los valores de las absorbancias de cada una de las frecuencias de las regiones comprendidas entre 1500-1300 cm-1, 1600-1500 cm-1, 1700-1600 cm-1, y 31002800 cm-1 se determinan a partir del espectro previamente normalizado respecto a la absorbancia de la banda amida I en la región 1700-1600 cm-1, y referido a un mismo valor de absorbancia en la frecuencia de 1800 cm

.

13. Método según la reivindicación 12, caracterizado porque la comparación de la etapa 1d comprende un análisis multivariante de mínimos cuadrados parciales que utiliza:

-como variables independientes los valores de las absorbancias de cada una de las frecuencias de las regiones comprendidas entre 1500-1300 cm-1, 1600-1500 cm-1, 1700-1600 cm-1, y 3100-2800 cm-1 del espectro de la primera muestra de sangre y los valores de las absorbancias de cada una de las frecuencias de las regiones comprendidas entre 1500-1300 cm-1, 1600-1500 cm-1, 1700-1600 cm-1, y 3100-2800 cm-1 del espectro de cada muestra de sangre de referencia;

-y como variable dependiente el valor de GDS numérico en la escala de deterioro global cognitivo de Reisberg que corresponde a la subclase definida en I-a, II-a, II-b, II-c, II-d y II-e de dicha segunda muestra de sangre de referencia.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13 para obtener una indicación de la presencia o ausencia de una condición de enfermedad de Alzheimer en una muestra de sangre obtenida.

15. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 para obtener una indicación del grado de deterioro global cognitivo asociado a la enfermedad de Alzheimer en una muestra de sangre obtenida.

16. Kit de obtención de una muestra para medida espectroscópica del deterioro global cognitivo asociado a la enfermedad de Alzheimer que comprende al menos un tubo de fraccionamiento de sangre y al menos un cristal soporte de muestra insoluble en agua apto como ventana para espectroscopía infrarroja de transmisión en el intervalo 3100-1300 cm-1.

FIGURA 1

FIGURA 2

FIGURA 3

FIGURA 4

012345678 Valores reales de GDS

FIGURA 5