Análisis dimensional de conjugados de sacáridos con GPC y SEC-MALS.

Una composición que comprende:

un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo A de N.

meningitidis, en la que el tamaño molecular delconjugado es 5,71 ± 2% nm (57,1 ± 2% Å) y la masa molar del conjugado es 88,5 ± 2% kDa,

un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo C de N. meningitidis, en la que el tamaño molecular delconjugado es 5,70 ± 2% nm (57,0 ± 2% Å) y la masa molar del conjugado es 85,2 ± 2% kDa,

un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo de W135 de N. meningitidis, en la que el tamaño molecular delconjugado es 6,87 ± 2% nm (68,7 ± 2% Å) y la masa molar del conjugado es 110,1 ± 2% kDa, y

un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo Y de N. meningitidis, en la que el tamaño molecular delconjugado es 6,33 ± 2% nm (63,3 ± 2% Å) y la masa molar del conjugado es 84,7 ± 2% kDa,

en la que el transportador de proteína para cada conjugado es CRM 197.

CAMPO TÉCNICO

La presente invención está en el campo del análisis y el control de calidad de vacunas que incluyen sacáridos capsulares bacterianos que están conjugados con un transportador.

TÉCNICA ANTERIOR

Los inmunógenos que comprenden antígenos de sacáridos capsulares conjugados con proteínas transportadoras son muy conocidos en la técnica. La conjugación convierte antígenos independientes de T en antígenos dependientes de T, potenciando así respuestas de memoria y permitiendo inmunidad protectora para el desarrollo, y la vacuna de conjugado prototipo era para Haemophilus influenzae tipo b (Hib) [por ejemplo, véase el Capítulo 14 de la ref. 1]. Desde la vacuna de Hib se han desarrollado vacunas de sacáridos conjugados para proteger contra Neisseria meningitidis (meningococo) y contra Streptococcus pneumoniae (neumococo) . Otros organismos en los que las vacunas de conjugado son de interés son Streptococcus agalactiae (estreptococo del grupo B) [2], Pseudomonas aeruginosa [3] y Staphylococcus aureus [4].

En vez de usar sacáridos capsulares de longitud completa es posible seleccionar fragmentos de oligosacáridos de tamaño deseado después de una etapa de hidrólisis [por ejemplo, la ref. 5], y se ha informado que conjugados preparados con oligosacáridos de longitud de cadena media ofrecen inmunogenicidad mejorada [por ejemplo, las refs. 6 y 7]. De las tres vacunas conjugadas del serogrupo C de N. meningitidis que se han aprobado para uso humano, Menjugate™ [8] y Meningitec™ se basan en oligosacáridos, mientras que NeisVac-C™ usa polisacárido de longitud completa.

Cuando los conjugados se incluyen en una vacuna, el control de calidad de la fabricación y liberación generalmente requiere que tengan un tamaño molecular y/o masa molar definidos, y también que estos parámetros sean coherentes entre lotes. El tamaño molecular y la masa molar también pueden usarse para monitorizar la estabilidad de vacunas, ya que los conjugados pueden agregarse con el tiempo, provocando un aumento en el tamaño y la masa.

Es un objetivo de la invención proporcionar procedimientos nuevos y mejorados para medir el tamaño molecular, masa molar y parámetros relacionados para antígenos de sacáridos conjugados, en particular para conjugados de sacáridos meningocócicos.

El documento WO 02/058737 desvela un vacuna de conjugado meningocócica multivalente que comprende polisacáridos de los serogrupos A, C, W-135 e Y. En algunos casos, el documento WO 02/058737 menciona medir el tamaño de los conjugados, pero no se facilitan datos.

D'Ambra y col. (Developments in Biologicals, 2000, 103, 2000, páginas 241 - 242) trata de intentos de usar fotometría de dispersión de la luz de múltiples ángulos y refractometría diferencial (SEC-MALS/RI) con productos intermedios de polisacáridos meningocócicos y neumocócicos.

Jumel y col. (Biotechnology and Applied Biochemistr y , 2002, 36, 3, páginas 219 - 226) describen el trabajo experimental usando SEC-MALS/RI que implica conjugados de MenC con una amplia variedad de diferentes tamaños.

Lemercinier y col. (Pharmaceutical Sciences 1997, 3, 1, páginas 19 - 23) se refiere a RMN y cromatografía de líquidos rápida de proteínas (FPLC) para su uso en ensayos que implican Haemophilus influenza tipo b y conjugados de MenC.

Ho y col. (Vaccine, 2000, 19, 7 - 8, páginas 716 - 725) se refiere a conjugados de C-CRM197 meningocócicos que estuvieron aparentemente comercialmente disponibles. No se desvelan valores absolutos para el tamaño o masa de los conjugados.

Von Hunolstein y col. (Vaccine, 1999, 17, 2, 118 - 125) desvelan análisis de vacunas de conjugado de Haemophilus influenza tipo b.

El documento WO 2004/032958 se refiere a vacunas para la protección contra linajes meningocócicos hipervirulentos. Desvela diversos conjugados de proteína – polisacárido, pero no desvela su masa molecular o tamaño molar.

El documento WO 2005/103230, que puede encontrarse bajo el Artículo 54 (3) CPE dependiendo de la validez de las reivindicaciones de prioridad implicadas, se refiere a peptona de soja como fuente de nitrógeno en la preparación de

conjugados meningocócicos. Desvela diversos conjugados de proteína – polisacárido, pero no enseña su masa molecular o molar tamaño.

El documento WO 2005/032583, que puede encontrarse bajo el Artículo 54 (3) CPE dependiendo de la validez de las reivindicaciones de prioridad implicadas, desvela diversos conjugados de proteína – polisacárido, pero no desvela su masa molecular o molar tamaño.

DIVULGACIÓN DE LA INVENCIÓN

Los inventores han descubierto que la cromatografía de exclusión molecular y SEC-MALS (cromatografía de exclusión por tamaño con detección por fotometría de dispersión de la luz de múltiples ángulos) puede usarse para medir con exactitud y de forma fidedigna el tamaño molecular y la masa molar, respectivamente, de conjugados de sacáridos.

Así, la solicitud proporciona un procedimiento para medir el tamaño molecular de un antígeno de sacárido conjugado dentro de una muestra, que comprende una etapa de analizar la muestra por cromatografía de exclusión molecular. El tiempo de retención del análisis de cromatografía puede convertirse en un radio de viscosidad (Rη) , por ejemplo, por comparación con una curva de calibración, permitiendo así el simple cálculo del tamaño molecular. El tamaño molecular promedio y/o la distribución de tamaños moleculares de conjugados en la muestra pueden determinarse fácilmente de esta forma.

La solicitud también proporciona un procedimiento para medir la masa molar de un antígeno de sacárido conjugado dentro de una muestra, que comprende una etapa de analizar la muestra por SEC-MALS. El tiempo de retención de SEC puede convertirse en masa molar. La masa molar promedio y/o distribución de masa molar (polidispersidad) de conjugados en la muestra puede determinarse fácilmente de esta forma. La referencia 9 informa de que SEC-MALS se ha usado previamente para medir sacáridos neumocócicos y meningocócicos de pre-conjugación, pero no se informan datos de post-conjugación. La invención es las composiciones y lotes descritos en las reivindicaciones.

El sacárido El procedimiento permite la medición de parámetros para antígenos de sacáridos conjugados. El antígeno de sacárido es normalmente un sacárido capsular bacteriano, por ejemplo, de Neisseria meningitidis (serogrupos A, B, C, W135 o Y) , Streptococcus pneumoniae (serotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F o 23F) , Streptococcus agalactiae (tipos Ia, Ib, II, III, IV, V, VI, VII o VIII) , Haemophilus influenzae (cepas tipables: a, b, c, d, e o f) , Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, etc. Otros analitos de sacárido incluyen glucanos (por ejemplo, glucanos fúngicos tales como aquellos en Candida albicans) , y sacáridos capsulares fúngicos, por ejemplo, de la cápsula de Cr y ptococcus neoformans. El procedimiento es particularmente útil para analizar sacáridos capsulares de los serogrupos A, C, W135e Y de N. meningitidis.

La cápsula del serogrupo A de N. meningitidis es un homopolímero de N-acetil-D-manosamina-1-fosfato ligado en (α1-6) , con O-acetilación parcial en las posiciones C3 y C4. La cápsula del serogrupo B de N. meningitidis es un homopolímero de ácidos siálicos ligados en (α2-8) . El sacárido capsular del serogrupo C de N. meningitidis es un homopolímero de ácido siálico ligado en (a2-9) (ácido N-acetilneuramínico, o 'NeuNAc') , con O-acetilación variable en las posiciones 7 y/u 8. El sacárido del serogrupo W135 de N. meningitidis es un polímero que consiste en unidades de disacáridos de ácido siálico-galactosa [-4) -D-Neup5Ac (7/90Ac) -α- (2-6) -D-Gal-α- (1-], con Oacetilación variable en las posiciones 7 y 9 del ácido siálico [10]. El sacárido del serogrupo Y de N. meningitidis es similar al sacárido del serogrupo W135, excepto que la unidad de repetición de disacáridos incluye glucosa en lugar de galactosa [-4) -D-Neup5Ac (7/90Ac) -α- (2-6) -D-Glc-α- (1-]. El sacárido capsular de tipo b de H. influenzae es un polímero de ribosa, ribitol y fosfato ['PRP', (poli-3-º-D-ribosa- (1, 1) -D-ribitol-5-fosfato) ].

Otros antígenos de sacáridos preferidos son sacáridos eucariotas, por ejemplo, sacáridos fúngicos, sacáridos de planta, sacáridos humanos (por ejemplo, antígenos del cáncer) , etc. Otros sacáridos preferidos son lipopolisacáridos y lipooligosacáridos.

El antígeno de sacárido puede estar en una forma como se encuentra en la naturaleza, o puede estar en una forma derivada, por ejemplo, de un sacárido que se ha sometido a alteración y/o despolimerización... [Seguir leyendo]

1. Una composición que comprende:

un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo A de N. meningitidis, en la que el tamaño molecular del conjugado es 5, 71 ± 2% nm (57, 1 ± 2% Å) y la masa molar del conjugado es 88, 5 ± 2% kDa, un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo C de N. meningitidis, en la que el tamaño molecular del conjugado es 5, 70 ± 2% nm (57, 0 ± 2% Å) y la masa molar del conjugado es 85, 2 ± 2% kDa, un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo de W135 de N. meningitidis, en la que el tamaño molecular del

conjugado es 6, 87 ± 2% nm (68, 7 ± 2% Å) y la masa molar del conjugado es 110, 1 ± 2% kDa, y un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo Y de N. meningitidis, en la que el tamaño molecular del conjugado es 6, 33 ± 2% nm (63, 3 ± 2% Å) y la masa molar del conjugado es 84, 7 ± 2% kDa,

en la que el transportador de proteína para cada conjugado es CRM 197. 15

2. Dos lotes de una vacuna, en los que: (a) ambos lotes de vacuna comprenden: (i) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo A de Neisseria meningitidis; (ii) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo C de Neisseria meningitidis; (iii) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo W135 de Neisseria meningitidis; (iv) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo Y de Neisseria meningitidis, en los que cada conjugado es como se define en la reivindicación 1; (b) el tamaño molecular del sacárido del serogrupo A en el primer lote es A1 y el tamaño molecular del sacárido del serogrupo A en el segundo lote es A2; (c) el tamaño molecular del sacárido del serogrupo C en el primer lote es C1 y el tamaño molecular del sacárido del serogrupo C en el segundo lote es C2;

(d) el tamaño molecular del sacárido del serogrupo W135 en el primer lote es W1 y el tamaño molecular del sacárido del serogrupo W135 en el segundo lote es W2; (e) el tamaño molecular del sacárido del serogrupo Y en el primer

lote es Y1 y el tamaño molecular del sacárido del serogrupo Y en el segundo lote es Y2; (f) las relaciones A1/A2, C1/C2, W1/W2 y Y1/Y2 están cada una entre 0, 95 y 1, 05.

3. Dos lotes de una vacuna, en los que: (a) ambos lotes de vacuna comprenden: (i) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo A de Neisseria meningitidis; (ii) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo C de 30 Neisseria meningitidis; (iii) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo W 135 de Neisseria meningitidis; (iv) un conjugado de un sacárido capsular del serogrupo Y de Neisseria meningitidis, en los que cada conjugado es como se define en la reivindicación 1; (b) la masa molar del sacárido del serogrupo A en el primer lote es A 1 y la masa molar del sacárido del serogrupo A en el segundo lote es A2; (c) la masa molar del sacárido del serogrupo C en el primer lote es C1 y la masa molar del sacárido del serogrupo C en el segundo lote es C2; (d) la masa molar del

sacárido del serogrupo W135 en el primer lote es W1 y la masa molar del sacárido del serogrupo W135 en el segundo lote es W2; (e) la masa molar del sacárido del serogrupo Y en el primer lote es Y1 y la masa molar del sacárido del serogrupo Y en el segundo lote es Y2; (f) las relaciones A1/A2, C1/C2, W1/W2 y Y1/Y2 están cada una entre 0, 95 y 1, 05.