Amplificación y secuenciación de dianas con cebadores que comprenden unidades monoméricas formadoras de tríplex.

Un procedimiento que comprende las etapas de:

a. Proporcionar un ácido nucleico plantilla

b.

Proporcionar un primer oligonucleótido

c. Proporcionar una polimerasa

d. Proporcionar nucleótidos trifosfatos

e. Mezclar los componentes de las etapas a-d y proporcionar condiciones, que permitan al cebador hibridarse con laplantilla

-en el que el primer oligonucleótido es un oligonucleótido de una longitud entre 5 y 60 nt, que comprende unmonómero TINA de la fórmula Z,

-en el que Z se describe mediante la estructura general:

X - L - I1 - C - I2

-en la que X es una unidad monomérica estructural que se puede incorporar en la estructura de un oligonucleótido oun análogo nucleotídico, o PNA, o análogos de PNA, L es un engarce, I1 es un primer intercalante que comprende almenos un sistema conjugado esencialmente plano, que es capaz de co-apilarse con bases nucleotídicas de ADN,ARN o análogos de las mismas, C es un conjugador opcional e I2 es un segundo intercalante que comprende unsistema conjugado esencialmente plano, que es capaz de co-apilarse con bases nucleotídicas de ADN, ARN oanálogos de las mismas

f. En condiciones que permiten prolongación del cebador, prolongar el primer oligonucleótido hibridado con laplantilla.

Amplificación y secuenciación de dianas con cebadores que comprenden unidades monoméricas formadoras de tríplex 5

Antecedentes La detección, la amplificación y secuenciación de ácidos nucleicos son procedimientos cruciales en biología molecular, en investigación así como en diagnósticos clínicos y los reactivos clave en dichos procedimientos son oligonucleótidos que actúan como cebadores y/o sondas.

De gran importancia para los cebadores y las sondas son su especificidad de secuencia y también su afinidad por un ácido nucleico complementario. Estas características se pueden modular mediante factores intrínsecos al oligonucleótido y factores extrínsecos al oligonucleótido. Los factores intrínsecos son por ejemplo la longitud y la composición de la secuencia de ácidos nucleicos de los oligonucleótidos. Además los usos de nucleótidos no naturales o modificaciones en la estructura son factores intrínsecos. No obstante, el número de nucleótidos no naturales y unidades estructurales disponibles es limitado. De acuerdo con ello, existe la necesidad de oligonucleótidos con modificaciones novedosas que se puedan usar en procedimientos de biología molecular.

La solicitud de patente WO 2006/125447 describió una unidad monomérica formadora de tríplex de la fórmula Z (que se describe más adelante) y demostró características favorables de un oligonucleótido que comprende una unidad monomérica formadora de tríplex con respecto a la formación de tríplex con un ácido nucleico bicatenario. En base a las características de formación de tríplex, los autores de la solicitud de patente mencionada anteriormente sugieren usar el oligonucleótido para la detección, el diagnóstico y el tratamiento. No se proporcionaron detalles ni datos de dichos usos.

Filichev y cols., (Filichev VV, 2005) describieron la misma unidad monomérica formadora de tríplex que el documento WO 2006/125447 y encontraron estabilización del dúplex paralelo y del tríplex paralelo mediante incorporación de la unidad monomérica formadora de tríplex. Además, encontraron desestabilización de de los dúplex ARN/ADN y ADN/ADN de tipo Watson-Crick cuando las unidades monoméricas formadoras de tríplex se insertaron en un oligonucleótido, en comparación con el oligonucleótido nativo.

Breve descripción de las figuras Figura 1: La síntesis de monómeros de ácidos nucleicos intercalantes que contienen un grupo 1H-fenantro[9, 10d]imidazol-2-ilo.

Figura 2: La síntesis de monómero de ácido nucleico intercalante que contiene una modificación de tipo Sonogahira (i) Reacción de 8 con 3 o reacción de 9 con 2 ambas usando Pd (PPh3) 4, CuI, DMF/Et3N, Ar. (ii) NH4OH al 32 % o solución etanólica de tris (2-aminoetil) amina al 50 %, a temperatura ambiente durante 2 horas después a 55 ºC durante la noche. (iii) RP-HPLC; AcOH acuoso al 80 %, AcONa acuoso 3 M, EtOH al 99 %.

Figura 3: La síntesis de 2- y 4-etinilpirenos en las posiciones para y orto de (R) -1-O-fenilmetilglicerol y su incorporación en oligonucleótidos 45 Reactivo y condiciones para la síntesis: i) H2 (16211999, 45 pascales (160 atm) ) , Pd al 10 %/C, EtOAc, 60 ºC, 24 horas; ii) Ac2O2, Alcl3, Ch2Cl2, 5 ºC; iii) 2, 3-dicloro-5, 6-diciano-1, 4-benzoquinona (DDQ) , tolueno, 110 ºC, 1 hora; iv) DMF, POCL3; v) KOH, dioxano, reflujo, 2 horas.

Figura 4: Un grupo 1H-fenantro[9, 10-d]imidazol-2-ilo.

Sumario de la invención Los autores de la presente invención han descubierto que la incorporación de una unidad monomérica formadora de tríplex (en el presente documento también denominada monómero TINA) en oligonucleótidos da sorprendentemente 55 una serie de características favorables. Además, han descubierto que los oligonucleótidos que comprende un monómero formador de tríplex se pueden usar como sustratos de manipulaciones enzimáticas tales como prolongación de cebadores.

Por tanto, un primer aspecto es un oligonucleótido de una longitud entre 5 y 60 nt (nucleótidos) , que comprende al menos una unidad monomérica TINA de la fórmula Z, en el que dicho (s) monómero (s) se localiza (n) en una posición que tiene al menos 1 monómero desde el extremo 3' del oligonucleótido.

Dicho oligonucleótido se puede usar en varios procedimientos biológicos moleculares.

Por tanto, un segundo aspecto de la invención es un procedimiento que comprende las etapas de

a. Proporcionar un ácido nucleico plantilla

b. Proporcionar un primer cebador

c. Proporcionar una polimerasa

d. Proporcionar nucleótidos trifosfatos

e. Mezclar los componentes de las etapas a-d y proporcionar condiciones, que permitan al cebador hibridarse con la plantilla

-en el que el cebador es preferentemente un oligonucleótido de la invención.

Las etapas puede ser parte de una técnica de biología molecular, tal como una reacción de secuenciación, una reacción de transcripción o un procedimiento de amplificación del ácido nucleico diana (NAT) -tal como reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , amplificación basada en secuencias de ácidos nucleicos (NASBA) , amplificación mediada por transcripción (TMA) , amplificación por desplazamiento de hebra (SDA) o reacción en cadena de la ligasa (LCR) . Si las etapas son parte de una reacción NAT, la reacción NAT se puede realizar simplemente para amplificar una región diana del ácido nucleico plantilla. Como alternativa, la NAT se puede realizar de forma cuantitativa para determinar la cantidad de una región diana del ácido nucleico plantilla. Una reacción NAT cuantitativa (p. ej., PCR) puede comprender sondas de detección que pueden ser oligonucleótidos de la invención.

Los oligonucleótidos de la invención son ventajosos porque permiten la modulación de la temperatura de fusión de un oligonucleótido, tienen una especificidad de secuencia mejorada y pueden formar triples mediante apareamiento de Hoogsteen o apareamiento de bases de Hoogsteen inverso con ácidos nucleicos bicatenarios. Además, algunas realizaciones de los oligonucleótidos de la invención tienen características de fluorescencia útiles.

Divulgación de la invención

Oligonucleótido En un primer aspecto, la presente divulgación proporciona un oligonucleótido de una longitud entre 5 y 60 nt que comprende un monómero TINA de la fórmula Z, en el que dicho monómero TINA está localizado en una posición que tiene al menos 1 monómero desde el extremo 3' del oligonucleótido.

Incluso se prefiere más una longitud entre 8 y 50 nt y lo que más se prefiere es una longitud entre 10 y 40 nt.

Unidad monomérica formadora de tríplex, Z

Z se puede describir mediante la estructura general:

X-L -I1 - C - I2

en la que X es una unidad monomérica estructural que se puede incorporar en la estructura de un oligonucleótido o un análogo nucleotídico, o PNA, o análogos de PNA, L es un engarce, I1 es un primer intercalante que comprende al menos un sistema conjugado esencialmente plano, que es capaz de co-apilarse con bases nucleotídicas de ADN, ARN o análogos de las mismas, C es un conjugador opcional e I2 es un segundo intercalante que comprende un sistema conjugado esencialmente plano, que es capaz de co-apilarse con bases nucleotídicas de ADN, ARN o 45 análogos de las mismas.

Un monómero de apilación de bases flexible (Z) comprende al menos dos sistemas intercalantes I1 e I2 que están unidos mediante un conjugador C que proporciona la rigidez estructural y la flexibilidad a la torsión necesarias. Lo último se cree que es importante para ayudar a los intercalantes a ajustarse ellos mismos en una posición adecuada dentro de la hélice de ácido nucleico.

En una realización preferida, la estructura X es capaz de incorporarse dentro de un oligonucleótido de ADN, ARN, HNA, MNA, ANA, LNA, CAN, INA, CeNA, TNA, (2'-NH) -TNA, (3'-NH) -TNA, a-L-Ribo-LNA, a-L-Xilo-LNA, º-D-Ribo-LNA, º-D-Xilo-LNA, [3.2.1]-LNA, Biciclo-ADN, 6-Amino-Biciclo-ADN, 5-epi-Biciclo-ADN, a-Biciclo-ADN, Triciclo-ADN,

Biciclo[4.3.0]-ADN, Vícialo[3.2.1]-ADN, Biciclo[4.3.0]amida-ADN, º-D-Ribopiranosil-NA, a-L-Lixopiranosil-NA, 2'-R-ARN, 2'-OR-ARN, 2'-AE-ARN, a-L-ARN, º-D-ARN y combinaciones y modificaciones de los mismos.

En otra realización, la unidad monomérica estructural X comprende un alquilendiol, tal como etilenglicol o 1-Ometilenglicerol que opcionalmente tiene el alquilendiol parcialmente comprendido en un sistema anular, tal como glicón. Por ejemplo, el monómero estructural X puede ser una parte de anillos de cuatro, cinco o seis miembros que, en última instancia, tienen heteroátomos seleccionados de nitrógeno, azufre, fósforo y oxígeno. Preferentemente, el alquilendiol une directamente... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento que comprende las etapas de:

a. Proporcionar un ácido nucleico plantilla

b. Proporcionar un primer oligonucleótido

c. Proporcionar una polimerasa

d. Proporcionar nucleótidos trifosfatos

e. Mezclar los componentes de las etapas a-d y proporcionar condiciones, que permitan al cebador hibridarse con la 10 plantilla - en el que el primer oligonucleótido es un oligonucleótido de una longitud entre 5 y 60 nt, que comprende un monómero TINA de la fórmula Z, -en el que Z se describe mediante la estructura general:

X-L -I1 - C - I2

-en la que X es una unidad monomérica estructural que se puede incorporar en la estructura de un oligonucleótido o un análogo nucleotídico, o PNA, o análogos de PNA, L es un engarce, I1 es un primer intercalante que comprende al

menos un sistema conjugado esencialmente plano, que es capaz de co-apilarse con bases nucleotídicas de ADN, ARN o análogos de las mismas, C es un conjugador opcional e I2 es un segundo intercalante que comprende un sistema conjugado esencialmente plano, que es capaz de co-apilarse con bases nucleotídicas de ADN, ARN o análogos de las mismas f. En condiciones que permiten prolongación del cebador, prolongar el primer oligonucleótido hibridado con la plantilla.

2. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que Z está localizada en el extremo 5’

del oligonucleótido. 30

3. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que X es una unidad monomérica estructural de un oligonucleótido o un análogo oligonucleotídico, o PNA o análogos de PNA y en el que X comprende alquilendiol, L es un engarce que comprende una cadena alquilo, una cadena oxaalquilo, una cadena azaalquilo, una cadena tiaalquilo, un grupo carboxamida, un grupo tiocarboxamida, un grupo sulfonamida o combinaciones de los mismos y comprende entre 0-60, I1 es un sistema anular aromático monocíclico o policíclico seleccionado del grupo que consiste en benceno, naftaleno, azuleno y sistemas anulares heteroaromáticos bicíclicos, I1 se selecciona del grupo de sistemas anulares aromáticos bicíclicos, sistemas anulares aromáticos tricíclicos, sistemas anulares aromáticos tetracíclicos, sistemas anulares aromáticos pentacíclicos y análogos heteroaromáticos de los mismos y sustituciones de los mismos.

4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que C es un conjugador seleccionado del grupo de alquilo de 1 a 12 carbonos, alquenilo de 2 a 12 carbonos, alquinilo de 2 a 25 carbonos o diazo o combinaciones de los mismos con una longitud de no más de 25 átomos de carbono y/o nitrógeno.

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que I1 e I2 están unidos directamente mediante un sistema conjugado.

6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que Z se puede describir mediante la fórmula:

-en la que R se selecciona del grupo de ariletinilo.

7. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el oligonucleótido comprende adicionalmente unidades monoméricas de nucleótidos modificados seleccionadas del grupo que consiste en 55 unidades de ADN, unidades de ARN, unidades de LNA y unidades 2’-OH-modificadas.

8. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el extremo 3’ del oligonucleótido comprende una tira contigua de 3 desoxinucleótidos.

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el oligonucleótido comprende además un sitio de restricción.

10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el oligonucleótido comprende además un fluoróforo seleccionado del grupo que consiste en FAM™, TET™, JOE™, VIC™, SYBR® Green, 6 FAM,

HEX, TET, TAMRA, JOE, ROX, Fluoresceína, Cy3, Cy5, Cy5.5, Rojo Texas, Rodamina, Verde Rodamina, Rojo Rodamina, 6-CarboxiRodamina 6G, Verde Oregón 488, Alexa Flour, Verde Oregón 500 y Verde Oregón 514.

11. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el oligonucleótido comprende además un pigmento inactivador seleccionado del grupo que consiste en TAMRA™, Black Hole Quencher™, 15 DABCYL, BHQ-1, BHQ-2, DDQ I, DDQ II y Eclipse Dark Quencher.

12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el oligonucleótido o los nucleótidos trifosfatos están marcados con fluorescencia.

13. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que una fracción de los nucleótidos trifosfatos son didesoxinucleótidos trifosfatos.

14. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes que comprende adicionalmente las etapas de 25

g. Proporcionar un segundo oligonucleótido, que es complementario al primer producto de prolongación de la etapa f

h. Desnaturalizar el producto de la etapa f

i. En condiciones que permiten la prolongación del cebador, prolongar el segundo oligonucleótido hibridado con el

primer producto de prolongación. 30

15. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que el segundo oligonucleótido es un oligonucleótido que comprende un monómero TINA según se describe en cualquiera de las reivindicaciones 1-13.