Procedimiento para aislar productos celulares por crioconservación.

Procedimiento de aislamiento de islotes pancreáticos, que comprende las etapas siguientes:

pretratar in vitro el tejido pancreático por:

- infusión de los islotes pancreáticos con una solución de crioprotector que comprende un agentecrioprotector a través de un sistema vascular, y

- infusión de tejido acinar con una solución acuosa a través de un sistema ductal.

proporcionar un tejido que presenta las células deseadas que son menos propensas a la congelación destructivay las células no deseadas que son más propensas a la congelación destructiva,

congelar el tejido,

disgregar el tejido,

calentar el tejido, y

separar las células deseadas del material celular no deseado para obtener los islotes pancreáticos.

Procedimiento para aislar productos celulares por crioconservación.

Referencia cruzada para la solicitud relacionada La presente solicitud no provisional reivindica los derechos de la solicitud provisional US nº 61/121.957, presentada el 12 de diciembre de 2008.

Antecedentes En la medicina moderna, las terapias celulares, la medicina regeneradora y en la ingeniería tisular conllevan en su totalidad tecnologías para recoger, expandir, modificar y reimplantar células y tejidos viables vivos. Un ejemplo principal es el trasplantes de islotes pancreáticos aislados de Langerhans para el tratamiento de la diabetes tipo I (dependiente de insulina) . El procedimiento de recogida de las células donantes requiere la separación controlada de las células terapéuticas deseadas de otras células no deseadas en el tejido del donante.

Históricamente, los procedimientos de aislamiento de islotes se han basado en el corte en bruto del tejido en fragmentos, que no puede separar las células diana de las células no deseadas. Actualmente, el campo del trasplante de islotes se basa en procesos enzimáticos de digestión que destruyen la matriz extracelular del tejido, liberando los islotes atrapados para su posterior tratamiento y purificación. Este procedimiento generalmente practicado tiene inconvenientes debido principalmente a la dificultad de controlar el proceso digestivo para producir una cantidad óptima de células viables. Por otra parte, el proceso es duro e incluso tóxico, causando alguna pérdida inevitable de valiosas células. Además, el proceso se basa en las formas más puras de las enzimas, que son muy costosas y todavía sujetas a las variaciones por lotes que han llevado a la variabilidad e inconsistencia en los intentos para optimizar y normalizar estos procesos.

Sumario Se describen procedimientos para el aislamiento de productos celulares que evitan, o reducen, la necesidad de digestión enzimática del producto celular y en su lugar se basan en las sensibilidades de las células a daños por congelación para efectuar la separación del tejido deseado del tejido no deseado en virtud de una técnica diferencia de congelación y crioconservación facilitada.

En las formas de realización, un producto celular se aísla mediante procedimientos que comprenden proporcionar un tejido que tiene las células deseadas que son menos propensas a la congelación destructiva y células no deseadas que son más propensas a la congelación destructiva, a la congelación del tejido, a la alteración del tejido, al calentamiento del tejido y a la separación de la células de las deseadas del material celular no deseado para obtener el producto celular.

En las formas de realización, el producto celular se aísla por procedimientos que comprenden el pretratamiento de un tejido tal que las células deseadas son menos propensas a la congelación destructiva y las células no deseadas son más propensas a la congelación destructiva, a la congelación del tejido, a la alteración del tejido, al calentamiento del tejido, y a la separación de las células deseadas de material celular no deseado para obtener el producto celular.

En las formas de realización, los islotes del páncreas se aíslan por procedimientos que comprenden infusión del tejido de los islotes con una solución crioprotectora que comprende un agente crioprotector (ACP) a través de un sistema vascular, infundiendo el tejido acinar con una solución acuosa a través de un sistema de conductos, congelando el páncreas, destruyendo el páncreas, calentando el páncreas y separando los islotes.

En las formas de realización, el tejido de los islotes pancreático que conserva suficiente integridad funcional para ser útil como un recurso para trasplantes se aísla por procedimientos que comprenden preparar quirúrgicamente páncreas ex vivo para la canulación vascular y ductal, enfriar el páncreas de aproximadamente 4ºC a aproximadamente 7ºC, equilibrar el tejido de los islotes con un agente crioprotector, infundir el páncreas con una solución acuosa por irrigación ductal para favorecer la frecuente formación de hielo en la congelación, congelar el páncreas a una temperatura de aproximadamente -10ºC a aproximadamente -200ºC, interrumpir mecánicamente el páncreas, manteniendo el páncreas congelado, descongelar el páncreas por inmersión en un medio para diluir el ACP, filtrar el páncreas, lavar el páncreas, y purificar en gradiente o cultivar el tejido de los islotes.

En la siguiente descripción detallada de las formas de realización se describen características y ventajas de la presente invención, y se pondrán de manifiesto a partir de la misma.

Breve descripción de los dibujos Las figuras 1A y 1B representan pretratamiento del páncreas para el crioaislamiento de tejido de los islotes. La figura 1C representa una vista ampliada de la sección definida por la línea A discontinua de las figuras 1A y 1B.

Las Figuras 2A y 2B representan la supervivencia del tejido de los islotes en función de la penetración del sulfóxido de dimetilo ("SODM") con diferentes ritmos de congelación y calentamiento.

Descripción detallada de las formas de realización Las formas de realización de la invención proporcionan un procedimiento sin enzimas o con enzimas reducidas para aislar productos celulares que es más consistente, fiable y menos tóxico que los procedimientos que se basan principalmente en la digestión con enzimas. Las formas de realización proporcionan un procedimiento que puede producir una cantidad óptima de células deseadas que conservan suficiente integridad funcional para ser útil como un recurso para trasplantes.

Las formas de realización de los procedimientos dados a conocer en la presente memoria pueden utilizarse para aislar cualquier producto celular para uso terapéutico y de investigación, siempre y cuando las células deseables y no deseables tengan, o pueden ser tratadas previamente para estimular, una respuesta diferencial de congelación. Dichos procedimientos pueden permitir reservar en un banco, enviar en estado congelado y suministrar el tejido congelado a un usuario final intacto, disminuyendo la sensibilidad de las células deseadas a la lesión isquémica.

En las formas de realización, un producto celular puede aislarse proporcionando un tejido que tiene células deseadas que son menos propensas a la congelación destructiva y células no deseadas que son más propensos a la congelación destructiva. El tejido puede tener propiedades intrínsecas de congelación diferencial que permitan la destrucción de algunas células y la conservación de otras células durante la congelación destructiva. Por ejemplo, el tejido puede comprender células que tienen diferentes temperaturas de nucleación en las que las células se convierten por congelación, tales como las células deseadas que tienen una temperatura de congelación inferior que las células no deseadas.

En las formas de realización, el producto celular puede aislarse tratando previamente un tejido, de modo que las células deseadas sean menos propensas a la congelación destructiva y las células no deseadas sean más propensas a la congelación destructiva. Por ejemplo, las células deseadas pueden llegar a ser menos propensos a la congelación destructiva infundiendo las células deseadas con un agente crioprotector (ACP) , y las células no deseadas pueden llegar a ser más propensas a la congelación destructiva mediante la infusión de las células no deseadas con una solución que no contiene un ACP. El tejido entonces puede congelarse y destruirse de tal manera que las células deseadas se separan de material celular no deseado para obtener el producto celular. El tejido puede calentarse y las células deseadas separarse del material celular no deseado para obtener un producto celular que comprende las células deseadas.

En las formas de realización, la crioconservación se utiliza para conservar selectivamente las células deseadas y destruir las células no deseadas. La crioconservación es un proceso complejo de calor y transferencia de masa acoplados, generalmente ejecutado en condiciones sin equilibrio. Sencillamente las células o tejidos en congelación generalmente dan lugar a materiales no funcionales muertos.

Durante el enfriamiento lento, el agua se retira de las células y tejidos a medida que comienza a formarse hielo en la zona extracelular. La transformación del agua en hielo fuera de la célula provoca un desequilibrio osmótico que produce la exósmosis del agua a la zona extracelular donde se congela en hielo. La pérdida de agua continúa hasta que se alcanzan temperaturas a las que la difusión de agua a través de la membrana resulta despreciable. La cantidad de pérdida de agua... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de aislamiento de islotes pancreáticos, que comprende las etapas siguientes: 5 pretratar in vitro el tejido pancreático por:

- infusión de los islotes pancreáticos con una solución de crioprotector que comprende un agente crioprotector a través de un sistema vascular, y

- infusión de tejido acinar con una solución acuosa a través de un sistema ductal. proporcionar un tejido que presenta las células deseadas que son menos propensas a la congelación destructiva y las células no deseadas que son más propensas a la congelación destructiva,

congelar el tejido, disgregar el tejido, calentar el tejido, y

separar las células deseadas del material celular no deseado para obtener los islotes pancreáticos.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además tratar los islotes pancreáticos con una enzima digestiva. 25

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el agente crioprotector se selecciona de entre el grupo que consiste en sulfóxido de dimetilo, glicerol, etilenglicol, propilenglicol, sacarosa y trehalosa.

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la solución acuosa es agua o solución salina isotónica. 30

5. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el pretratamiento del tejido comprende la infusión del tejido con una solución de crioprotector hasta que las células deseadas se equilibran termodinámicamente con el agente crioprotector.

6. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la infusión de los islotes pancreáticos con la solución de crioprotector se lleva a cabo a una temperatura desde aproximadamente 2°C a aproximadamente 35°C y durante un período de aproximadamente 20 a aproximadamente 70 minutos.

7. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la infusión del tejido acinar con una solución acuosa continúa 40 hasta que el tejido pancreático se distiende visiblemente.

8. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el agente crioprotector está presente en la solución de crioprotector a una concentración desde aproximadamente 0, 5 molar a aproximadamente 3, 0 molar.

9. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la congelación del tejido pancreático comprende congelar el páncreas a una temperatura desde aproximadamente -10ºC a aproximadamente -200ºC.

10. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la congelación del tejido pancreático se produce a un ritmo de enfriamiento de aproximadamente 1ºC/min a aproximadamente 20ºC/min. 50

11. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el calentamiento del tejido pancreático se produce a un ritmo de calentamiento superior a aproximadamente 12ºC/min.

12. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se consigue calentar el tejido pancreático por inmersión 55 directa del tejido en un medio caliente osmóticamente tamponado.

13. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se consigue disgregar el tejido pancreático por una técnica seleccionada del grupo que consiste en agresión mecánica, agresión termomecánica producida por expansión diferencial, agresión termomecánica producida por gradientes de temperatura pronunciados, y agresión 60 termomecánica producida por cambio de volumen al congelarse, y combinaciones de los mismos.

14. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se consigue disgregar el tejido pancreático mientras el tejido pancreático se congela o mientras el tejido pancreático se está descongelando.

15. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además eluir el agente crioprotector de los islotes pancreáticos y aplicar un tamponamiento osmótico al tejido pancreático durante la elución del agente crioprotector de los islotes pancreáticos.

16. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende además añadir una colagenasa al tejido pancreático a una concentración inferior a 1, 4 mg/ml.

17. Procedimiento de aislamiento de tejido de islotes pancreáticos que conserva suficiente integridad funcional para resultar útil como un recurso para trasplantes, comprendiendo el procedimiento: 10

-preparar quirúrgicamente un páncreas ex vivo para canulación vascular y ductal;

-enfriar el páncreas desde aproximadamente 2°C a aproximadamente 35°C;

-equilibrar el tejido de los islotes con un agente crioprotector;

-infundir el páncreas con agua destilada o solución salina por irrigación ductal para favorecer la formación de 15 hielo extensa al congelarse;

-congelar el páncreas a una temperatura desde aproximadamente -10ºC a aproximadamente -200°C;

-disgregar mecánicamente el páncreas mientras se mantiene el páncreas congelado;

-descongelar el páncreas por inmersión en un medio para diluir el agente crioprotector; filtrar el páncreas;

-lavar el páncreas con un medio que contiene un inhibidor de la proteasa y una desoxirribonucleasa; .

20. purificar en gradiente o cultivar el tejido de los islotes.