Procedimiento de aislamiento de endotoxinas.

Procedimiento de aislamiento de lipopolisacáridos caracterizado porque:

- el producto de partida es un conjunto de células bacterianas, o un líquido sobrenadante de cultivo;

- en una primera etapa, las células bacterianas o el líquido sobrenadante del cultivo, se suspenden en una mezclade disolventes constituida por:

- un disolvente elegido entre: ácidos alifáticos lineales o ramificados que comprenden de 3 a 6 átomosde carbono,

- una disolución acuosa básica de una amina alifática que comprende de 0 a 12 átomos de carbono,en una relación volumétrica de 1/9 a 9/1,

- y el conjunto se agita para dar una disolución en la que las partículas están en suspensión,

- en una segunda etapa, las partículas en suspensión se separan de la disolución

- sea por filtración de la composición,

- sea por centrifugación y recuperación del líquido sobrenadante,

- sea por centrifugación seguida de filtración del líquido sobrenadante;

- en una tercera etapa, los disolventes se eliminan del líquido sobrenadante o del filtrado.

Procedimiento de aislamiento de endotoxinas La invención tiene como objeto un nuevo procedimiento de extracción de endotoxinas a partir de bacterias, en particular de bacterias Gram negativas, así como el uso de este procedimiento para preparar composiciones que comprenden las endotoxinas o sus derivados y destinadas al uso humano o animal (uso científico, médico...) .

Las endotoxinas son potentes estimuladores del sistema inmunitario (inducción de interleuquinas, TNF, NO...) . Son los constituyentes principales de las membranas externas de las bacterias Gram negativas. Las endotoxinas son mezclas de lipopolisacáridos o LPS.

Entre las colonias bacterianas se distinguen principalmente dos categorías: las llamadas de tipo S, por “smooth” (lisas) , que se refiere al aspecto liso de la colonia; las llamadas de tipo R, por “rough” (rugosas) , cuyo término se refiere a la morfología rugosa de la colonia. Existe también una tercera categoría llamada SR por “semirough” (semirrugosa) .

La estructura de los LPS que constituyen las endotoxinas bacterianas es diferente según se trate de bacterias de tipo R o S. Los LPS están constituidos por un dominio lipídico, llamado lípido A y una cadena de polisacárido,

llamada núcleo, unida al lípido A.

Los LPS de tipo S constan además de una cadena antigénica llamada de tipo O. Los LPS de tipo R no constan de esta cadena antigénica de tipo O. Los LPS de tipo SR constan de una sola unidad de la cadena antigénica de tipo O.

La presente invención se refiere más en particular al aislamiento de endotoxinas a partir de un cultivo bacteriano de tipo R, y en su caso, de tipo S-R. Sin embargo, también se puede aplicar a cultivos bacterianos de tipo S.

En los procedimientos de la técnica anterior, las endotoxinas bacterianas se aislaban por extracción mediante una mezcla de disolventes que podía ser una mezcla de fenol y agua o una mezcla de cloroformo, éter de petróleo y

fenol. Estos procedimientos presentan el grave inconveniente de usar disolventes tóxicos y por lo tanto conllevan riesgos sanitarios para las personas que los manejan. También existe un procedimiento de extracción con ácido tricloroacético, sin embargo, este procedimiento implica demasiada contaminación para ser considerado satisfactorio.

Además, los restos de disolventes tóxicos en los extractos bacterianos de endotoxinas hacen que no sean adecuados para la administración humana o animal así como para el uso en experimentos científicos. Por último, la eliminación de estos residuos de disolventes tóxicos constituye una etapa difícil y costosa del procedimiento de la técnica anterior.

El documento de Caroff, M. y Karibian, D. “Several uses for Isobutyric Acid-Ammonium Hydroxide solvant in endotoxin analysis” Applied and Env. Microbiol. 56: 1957-1959 (1990) , describe el uso de una mezcla de disolventes de ácido isobutírico y NH4OH molar (5:3) , para determinar la pureza de endotoxinas bacterianas por cromatografía, así como para diferenciar las endotoxinas bacterianas procedentes de diferentes cepas.

Este documento describe también un procedimiento de purificación de endotoxinas naturales a partir de endotoxinas aisladas siguiendo uno de los procedimientos tradicionales de extracción con fenol en una primera etapa. En la segunda etapa de este procedimiento, las endotoxinas se purifican por extracción con una mezcla de disolventes de ácido isobutírico / NH4OH molar (5:3) .

El extracto se centrifuga y se recupera el líquido sobrenadante.

Se evaporan los disolventes. La endotoxina se recupera por trituración con etanol.

Por la lectura de este documento, el experto en la materia comprenderá que la extracción con fenol constituye la 55 primera etapa ineludible de cualquier procedimiento de aislamiento de endotoxinas bacterianas.

El documento de Thérisod, H., Labas, V. y Caroff, M. “Direct microextraction and analysis of rough-type lipopolysaccharides by combined thin-layer chromatography and MALDI mass spectrometr y ”. Anal. Chem. 73: 38043807 (2001) , describe un procedimiento de aislamiento de endotoxinas bacterianas, directamente a partir de bacterias, por cromatografía en placa de sílice, usándose como eluyente la mezcla de disolventes de ácido isobutírico / NH4OH (5:3) .

Sin embargo, la cromatografía en placa de sílice y la extracción con disolventes, son dos técnicas de separación 5 muy distintas y no existe una correlación entre los resultados obtenidos por estas dos técnicas.

Además, los autores de la invención han descubierto sorprendentemente un procedimiento nuevo de aislamiento de endotoxinas (o lipopolisacáridos) bacterianas directamente a partir de bacterias.

El procedimiento de acuerdo con la invención se caracteriza porque:

- el producto de partida es un conjunto de células bacterianas, o un líquido sobrenadante de cultivo;

- en una primera etapa, las células bacterianas o el líquido sobrenadante de cultivo, se suspenden en una mezcla de 15 disolventes constituida por:

- de 10 a 90%, preferiblemente de 30 a 70%, de un disolvente elegido de: ácidos alifáticos lineales o ramificados que comprenden de 3 a 6 átomos de carbono,

- de 90 a 10%, preferiblemente de 70 a 30%, de una disolución acuosa básica de una amina alifática 20 que comprende de 0 a 12 átomos de carbono,

- y el conjunto se agita para dar una disolución en la que las partículas están en suspensión,

- en una segunda etapa, las partículas en suspensión se separan de la disolución:

- sea por filtración de la composición,

- sea por centrifugación y recuperación del líquido sobrenadante,

-sea por centrifugación seguida de filtración del líquido sobrenadante;

- en una tercera etapa, los disolventes se eliminan del líquido sobrenadante o del filtrado por cualquier medio

conocido por el experto en la materia tal como, en particular: diálisis, filtración/lavado, precipitación de los LPS, por ejemplo, por adición de etanol.

El procedimiento de acuerdo con la presente invención, presenta numerosas ventajas en relación con los procedimientos de la técnica anterior. Es rápido: la extracción de las endotoxinas se hace en 12 a 24 horas o menos, 35 mientras que en los procedimientos de extracción con fenol, la etapa de extracción duraba al menos una semana.

Este método no usa sílice, es más sencillo llevar a cabo, en particular a escala industrial.

Este método no usa disolventes tóxicos, por lo tanto no es peligroso para las personas que lo llevan a cabo. 40 Es muy selectivo.

Los rendimientos son de 2 a 10 veces mayores que los obtenidos por los métodos de la técnica anterior para las bacterias ya ensayadas.

Los tratamientos enzimáticos habituales con ADNasa, ARNasa y proteasa, usados normalmente para eliminar los contaminantes de ADN, ARN, péptidos y proteínas residuales, en general no son necesarios.

Además, la ausencia de disolventes tóxicos, la rapidez y los buenos rendimientos del procedimiento de la invención 50 permiten contemplar su extrapolación a la escala industrial.

Por último, numerosos artículos recientes demuestran que algunos LPS comercializados actualmente y obtenidos por extracción en un sistema de fenol/agua, son portadores de contaminantes que los convierten en inutilizables en experimentos científicos. Los LPS obtenidos por el procedimiento de la invención presentan la ventaja de no ser

portadores de contaminantes.

Entre los ácidos alifáticos que se pueden usar en la presente invención, se elige preferiblemente un ácido ramificado. Se prefieren los ácidos alifáticos que comprenden 4 átomos de carbono, tales como los ácidos butírico e isobutírico. El ácido alifático usado preferiblemente en la presente invención es el ácido isobutírico.

Entre las aminas alifáticas que se pueden usar en la presente invención, se pueden citar en particular: amoniaco, diisopropiletilamina, trietilamina. Se elige preferiblemente amoniaco o trietilamina. Las aminas alifáticas se usan en disolución acuosa en una concentración de 5 a 20%, preferiblemente, una concentración de aproximadamente 10%.

La composición que resulta de la primera etapa es una composición heterogénea que consta por una parte de partículas de restos celulares en suspensión, por otra parte de las endotoxinas bacterianas en disolución en la mezcla de disolventes.

La eliminación de las partículas de restos celulares por filtración y/o centrifugación permite aislar las endotoxinas.

Si se desea purificar las endotoxinas... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de aislamiento de lipopolisacáridos caracterizado porque:

- el producto de partida es un conjunto de células bacterianas, o un líquido sobrenadante de cultivo;

- en una primera etapa, las células bacterianas o el líquido sobrenadante del cultivo, se suspenden en una mezcla de disolventes constituida por:

- un disolvente elegido entre: ácidos alifáticos lineales o ramificados que comprenden de 3 a 6 átomos de carbono,

- una disolución acuosa básica de una amina alifática que comprende de 0 a 12 átomos de carbono, en una relación volumétrica de 1/9 a 9/1,

- y el conjunto se agita para dar una disolución en la que las partículas están en suspensión, 15

- en una segunda etapa, las partículas en suspensión se separan de la disolución

- sea por filtración de la composición,

- sea por centrifugación y recuperación del líquido sobrenadante.

20. sea por centrifugación seguida de filtración del líquido sobrenadante;

- en una tercera etapa, los disolventes se eliminan del líquido sobrenadante o del filtrado.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque las células bacterianas se eligen entre las bacterias Gram negativas.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque las células bacterianas se eligen entre las bacterias Gram negativas de tipo R y S-R. 30

4. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque las células se eligen entre: Bordetella pertussis, Escherichia Coli, Bordetella parapertussis, Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Neisseria, Haemophilus.

5. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque los disolventes se eliminan del líquido sobrenadante o del filtrado por un procedimiento elegido entre: diálisis, filtración/lavado, precipitación.

6. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque se extrae la composición procedente de la tercera etapa del procedimiento mediante una mezcla de cloroformo y metanol.

7. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque la mezcla de disolventes consta de: 45

- un disolvente elegido entre: ácidos alifáticos lineales o ramificados que comprenden de 3 a 6 átomos de carbono,

- una disolución acuosa básica de una amina alifática que comprende de 0 a 12 átomos de carbono, en una relación volumétrica de 3/7 a 7/3.

8. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la mezcla de disolvente se elige entre: ácido isobutírico y trietilamina en disolución acuosa al 10% con una relación volumétrica 5/3.

9. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque la 55 mezcla de disolventes es una mezcla de ácido isobutírico y amoniaco en disolución acuosa molar con una relación volumétrica 5/3.

10. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la agitación en la primera etapa del procedimiento dura de 5 a 15 min.

11. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque la filtración se hace sobre un soporte que tiene una porosidad de 0, 1 a 2 μm.

12. Procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, caracterizado porque la centrifugación se hace en las siguientes condiciones: de 1500 a 3000 g, durante 10 a 20 min a temperatura ambiente.

13. Procedimiento para preparar una composición que comprende uno o varios lipopolisacáridos o derivados de lipopolisacáridos, destinada a la administración humana o animal, caracterizado porque comprende un procedimiento de aislamiento de lipopolisacáridos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, caracterizado porque la composición es una composición terapéutica. 15

15. Procedimiento según la reivindicación 14, caracterizado porque la composición es una composición de vacuna.