Aislamiento de ácidos nucleicos mediante la utilización de polidocanol y derivados del mismo.

Composición que comprende:

- un agente caotrópico,

- una sustancia tamponadora,

- una proteasa, y

- polidocanol al 0,5% a 4,9% (v/v) o un derivado del mismo.

Aislamiento de ácidos nucleicos mediante la utilización de polidocanol y derivados del mismo Campo de la invención La presente invención se refiere a una composición que comprende un agente caotrópico, una sustancia tamponadora, una proteasa y polidocanol al 0, 5% a 4, 9% (v/v) o un derivado del mismo. La invención se refiere además a usos de dicha composición y a un kit que comprende la composición según la invención. La invención se refiere además a un método para la detección de un ácido nucleico en una muestra biológica, que comprende las etapas de incubar la muestra biológica en presencia de un agente caotrópico, la muestra biológica en presencia de un agente caotrópico, una sustancia tamponadora, una proteasa y polidocanol al 0, 5% a 4, 9% (v/v) o un derivado del mismo, aislando opcionalmente el ácido nucleico, amplificando opcionalmente el ácido nucleico y detectando el ácido nucleico. La invención se refiere además a un método para la purificación de un ácido nucleico en una muestra biológica, que comprende las etapas de incubar la muestra biológica en presencia de un agente caotrópico, una sustancia tamponadora, una proteasa y polidocanol al 0, 5% a 4, 9% (v/v) o un derivado del mismo y aislar el ácido nucleico, purificando de esta manera el ácido nucleico.

Antecedentes de la invención Muchas sustancias biológicas, especialmente ácidos nucleicos, presentan retos especiales en términos de su aislamiento a partir de su ambiente natural. Por otra parte, con frecuencia se encuentran presentes en concentraciones muy bajas y, por otra parte, con frecuencia se encuentran en presencia de muchas otras sustancias sólidas y disueltas, por ejemplo tras la lisis de células. Esto dificulta el aislamiento o la medición, en particular en ensayos bioespecíficos que permitan la detección de analitos específicos, por ejemplo ácidos nucleicos, o el análisis específico de propiedades y desempeña un papel importante en el campo del diagnóstico y la bioanalítica en la investigación y el desarrollo. Son ejemplos de ensayos bioespecíficos, los ensayos de hibridación, los inmunoensayos y los ensayos de receptor-ligando. Los ensayos de hibridación utilizan el apareamiento específico de bases para la detección molecular de analitos ácidos nucleicos, por ejemplo ARN y ADN. Por lo tanto, las sondas oligonucleótidas con una longitud de 18 a 20 nucleótidos podrían permitir el reconocimiento específico de una secuencia complementaria seleccionada, por ejemplo en el genoma humano. Otro ensayo que implica la unión selectiva de dos cebadores oligonucleótidos es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , descrito en la patente US nº 4.683.195. Este método permite la amplificación selectiva de una región específica de ácidos nucleicos hasta niveles detectables por una polimerasa termoestable en presencia de desoxinucleótidos trifosfato en varios ciclos.

Tal como se ha indicado anteriormente, antes de que puedan analizarse las sustancias biológicas en uno de los ensayos anteriormente indicados o utilizarse para otros procedimientos, deben aislarse o purificarse a partir de muestras biológicas que contienen mezclas complejas de diferentes componentes, tales como, por ejemplo, componentes proteicos y no proteicos. Con frecuencia, para las primeras etapas, se utilizan procedimientos que permiten el enriquecimiento en el componente de interés, por ejemplo el ácido nucleico. Con frecuencia estos están contenidos en una célula bacteriana, una célula fúngica, una partícula vírica o la célula de un organismo más complejo, tal como una célula sanguínea humana o una célula vegetal. El componente de interés también puede denominarse "componente diana".

Para liberar el contenido de dichas células o partículas, pueden tratarse con enzimas o con compuestos químicos para disolver, degradar o desnaturalizar las paredes celulares de dichos organismos. Este procedimiento se denomina comúnmente lisis. La solución resultante, que contiene dicho material lisado, se denomina lisado. Un problema que aparece con frecuencia durante la lisis es que otros enzimas degradan el componente diana, por ejemplo desoxirribonucleasas o ribonucleasas, que degradan ácidos nucleicos, entran en contacto con el componente de interés durante la lisis. Estos enzimas degradativos también pueden encontrarse presentes fuera de las células o pueden haberse separado especialmente en diferentes compartimientos celulares antes de la lisis y ahora entran en contacto con el componente diana. Otros componentes liberados durante este procedimiento pueden ser, por ejemplo, endotoxinas pertenecientes a la familia de los lipopolisacáridos, que resultan tóxicos para las células y pueden provocar problemas para los productos destinados a la utilización en la terapia humana o animal.

Existe una diversidad de medios para resolver dicho problema, mencionado anteriormente. Es frecuente utilizar agentes caotrópicos tales como, por ejemplo, tiocianato de guanidinio o detergentes aniónicos, catiónicos, zwiteriónicos o no iónicos en el caso de que se pretenda liberar ácidos nucleicos. También resulta una ventaja utilizar proteasas que degraden rápidamente estos enzimas o proteínas no deseadas. Sin embargo, esto puede provocar otro problema, ya que dichas sustancias o enzimas pueden interferir con reactivos o componentes en etapas posteriores.

Los enzimas que pueden utilizarse ventajosamente en dichos procedimientos de lisis o preparación de muestras indicados anteriormente son enzimas que cortan los enlaces amida en los sustratos proteicos y que se clasifican como proteasas o (intercambiablemente) , peptidasas (ver Walsh C., Enzymatic Reaction Mechanisms, capítulo 3,

W.H. Freeman and Company, San Francisco, 1979) . Las proteasas que han sido utilizadas son, por ejemplo, las proteasas alcalinas (solicitud de patente WO nº 98/04730) o las proteasas ácidas (patente US nº 5.386.024) . La proteasa que se utiliza ampliamente para la preparación de muestras para el aislamiento de ácidos nucleicos es la proteinasa K de Tritirachium album (ver, por ejemplo, Sambrook J. et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor University Press, NY, USA, 1989) , que es activa a un pH aproximadamente neutro y pertenece a la familia de las proteasas conocidas por el experto en la materia como subtilisinas. Una subtilisina es una serina proteasa producida por bacterias u hongos Gram-positivos.

En las etapas siguientes de la preparación de muestras que siguen a la etapa de lisis, se realiza un enriquecimiento adicional en el componente diana. En el caso de que el componente diana sea un ácido nucleico, el ácido nucleico diana normalmente se extrae de las mezclas complejas de lisis antes de utilizarse en un ensayo basado en sondas.

Existen varios métodos para la extracción de ácidos nucleicos:

- métodos dependientes de la secuencia o bioespecíficos, tales como, por ejemplo:

- la cromatografía de afinidad

- la hibridación con sondas inmovilizadas

- métodos independientes de la secuencia o físico-químicos, tales como, por ejemplo:

- la extracción líquido-líquido con, por ejemplo fenol-cloroformo,

-la precipitación con, por ejemplo, etanol puro,

- la extracción con papel de filtro,

- la extracción con agentes formadores de micelas tales como, bromuro de cetil-trimetil-amonio,

- la unión a pigmentos intercalantes inmovilizados, por ejemplo derivados de acridina,

- la adsorción a gel de sílice o tierras diatomáceas,

- la adsorción a partículas vítreas magnéticas (PVM) o a partículas de organosilano bajo condiciones caotrópicas.

Resulta particularmente interesante para la extracción, la adsorción de los ácidos nucleicos a una superficie de vidrio, aunque también resultan posibles otras superficies. En los últimos años se han propuestos muchos procedimientos para el aislamiento de ácidos nucleicos de su ambiente natural a partir de la utilización de su comportamiento de unión a superficies de vidrio o de sílice.

Por ejemplo, la patente EP nº 0 389 063 da a conocer la unión de ácidos nucleicos a una superficie de sílice en presencia de agentes caotrópicos. Las solicitudes de patente WO nº 96/41811 y WO nº 01/37291 dan a conocer la unión de ácidos nucleicos a la superficie de sílice de partículas vítreas magnéticas. Los sistemas comerciales que se comercializan en el mercado son, por ejemplo, el sistema High Pure y el sistema MagNA Pure, disponibles de Roche Diagnostics, Mannheim, Alemania.

Con el fin de incrementar o influir sobre la lisis de la muestra biológica y/o el comportamiento de unión de los ácidos nucleicos a las superficies de sílice, se han utilizado diversos agentes en la... [Seguir leyendo]

1. Composición que comprende:

- un agente caotrópico,

- una sustancia tamponadora,

- una proteasa, y

- polidocanol al 0, 5% a 4, 9% (v/v) o un derivado del mismo.

2. Composición según la reivindicación 1, en la que la composición comprende polidocanol al 0, 5% a 3% (v/v) o un derivado del mismo, preferentemente la composición comprende polidocanol al 0, 75% a 1, 75% (v/v) o un derivado del mismo.

3. Composición según la reivindicación 1, en la que la composición comprende polidocanol al 1% a 4, 5% (v/v) o un derivado del mismo, preferentemente la composición comprende polidocanol al 1, 5% a 3% (v/v) o un derivado del mismo.

4. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el agente caotrópico es tiocianato de guanidinio, cloruro de guanidinio o urea.

5. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que la sustancia tamponadora es Tris (hidroximetil) -aminometano (TRIS) , fosfato, ácido N- (2-hidroxietil) -piperazín-N'- (2'-etanosulfónico) (HEPES) , acetato

o citrato.

6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el pH de la composición es ácido, preferentemente el pH de la composición es de entre 3 y 5.

7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que la composición comprende además un agente reductor.

8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la composición comprende tiocianato de guanidinio 4 M, citrato sódico 50 mM, DTT al 1% (p/v) y polidocanol al 3% (v/v) , pH 4.

9. Utilización de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, para la purificación de un ácido nucleico, para la unión de un ácido nucleico a una superficie sólida o para la detección de un ácido nucleico.

10. Kit que comprende una composición según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.

11. Kit según la reivindicación 10, caracterizado porque el kit contiene además un material con una afinidad para ácidos nucleicos, preferentemente un material con una superficie de sílice.

12. Kit según la reivindicación 11, caracterizado porque el material con una afinidad para los a´cidos nucleicos es una composición que comprende partículas vítreas magnéticas.

13. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, caracterizado porque el kit comprende además un tampón de lavado y un tampón de elución.

14. Método para la detección de un ácido nucleico en una muestra biológica, que comprende las etapas de:

a) incubar la muestra biológica en presencia de un agente caotrópico, una sustancia tamponadora, una proteasa y polidocanol al 0, 5% a 4, 9% (v/v) o un derivado del mismo, b) opcionalmente aislar el ácido nucleico, c) opcionalmente amplificar el ácido nucleico, y d) detectar el ácido nucleico.

15. Método según la reivindicación 14, en el que, en la etapa de amplificación c) , se amplifica el ácido nucleico mediante la reacción en cadena de la polimerasa.

16. Método para la purificación de un ácido nucleico en una muestra biológica, que comprende las etapas de:

a) incubar la muestra biológica en presencia de un agente caotrópico, una sustancia tamponadora, una proteasa y polidocanol al 0, 5% a 4, 9% (v/v) o un derivado del mismo, b) aislar el ácido nucleico, purificando de esta manera el ácido nucleico.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, en el que, en la etapa a) , la muestra biológica se incuba en presencia de un agente caotrópico, una sustancia tamponadora y polidocanol al 0, 5% a 3% (v/v) o un derivado del mismo preferentemente polidocanol al 0, 75% a 1, 75% (v/v) o un derivado del mismo.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 17, en el que la etapa de aislamiento b) comprende la unión del ácido nucleico a un material con una afinidad para los ácidos nucleicos, preferentemente un material con una superficie de sílice, opcionalmente lavar el ácido nucleico unido al material y eluir el ácido nucleico del material.

19. Método según la reivindicación 18, caracterizado porque el material con una superficie de sílice es una 10 composición que comprende partículas vítreas magnéticas.

20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 19, caracterizado porque la muestra biológica es un líquido procedente del cuerpo humano o animal, preferentemente sangre, plasma sanguíneo, suero sanguíneo u orina.

21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 14 a 20, caracterizado porque el ácido nucleico comprende ADN o ARN o ambos.

22. Método según la reivindicación 1, caracterizado porque el ADN o ARN o ambos se deriva de un microorganismo o de un virus, preferentemente el virus de la hepatitis A, el virus de la hepatitis B, el virus de la hepatitis C, el virus de 20 la inmunodeficiencia humana o el citomegalovirus.