Adyuvante inmnulógico para la formulación de vacunas y vacuna frente a Leishmaniasis que lo comprende.

Adyuvante inmunológico para la formulación de vacunas y vacuna frente a Leishmaniasis que lo comprende.

La presente invención se refiere al uso de compuestos que comprenden una molécula de naturaleza lipídica y un grupo vinil sulfona como adyuvante inmunológico. La molécula lipídica se une a un antígeno para formar un lipopéptido que actúa como vacuna. Además, la presente invención también se refiere a un inmunoadyuvante que comprende dichos compuestos, a una vacuna que comprende estos lipopéptidos, es decir, el compuesto de la invención utilizado como inmunoadyuvante y un antígeno y de forma particular, a la vacuna descrita anteriormente para Leishmaniasis.

ADYUVANTE INMNULÓGICO PARA LA FORMULACIÓN DE VACUNAS Y VACUNA FRENTE A LEISHMANIASIS QUE LO COMPRENDE

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a inmunoadyuvantes o adyuvantes inmunológicos y a vacunas que los comprenden. Más particularmente, se refiere a vacunas frente a Leishmaniasis que comprenden dichos inmunoadyuvantes.

ESTADO DE LA TÉCNICA

Vacunas Las vacunas constituyen, en las enfermedades para las que existen, el mejor método de prevención de cara a la salud personal y pública, teniendo como éxito indiscutible la inducción de una inmunoprofilaxis creada tras la vacunación. Ello ha llevado a la eliminación de algunas enfermedades que han supuesto auténticas lacras para la sanidad mundial, caso de la viruela, y a la casi desaparición de muchas de las enfermedades infecciosas que han azotado la humanidad, en aquellas poblaciones donde se practica este tipo de inmunoprofilaxis.

Las vacunas por lo general poseen dos ventajas sustanciales, son económicas y no inducen resistencias a los fármacos en los patógenos frente a las que van dirigidas.

En el caso de enfermedades virales, o para aquellas en las que la quimioterapia es 25 inexistente, costosa o muy tóxica, constituyen la mejor forma de lucha.

Las vacunas inducen en el sistema inmunitario respuestas eficaces frente al agente infeccioso causante de la enfermedad o frente a las toxinas liberadas por dicho agente, a fin de eliminar los efectos causantes de la enfermedad.

En definitiva, inducen frente a los patógenos o sus toxinas una respuesta inmune capaz de neutralizar los efectos adversos de los antígenos del patógeno, considerándose a los antígenos como sustancias capaces de inducir una respuesta inmune. Pudiendo ser estos antígenos, organismos completos, una porción de los mismos, que forman parte del agente infeccioso, o sustancias segregadas por éstos o incluso cualquier sustancia natural, sintética u obtenida de forma artificial y que seasemeja a las naturales que posee o excreta el agente patógeno.

Una vez que el sistema inmunitario ha sido sensibilizado al organismo patógeno, la exposición ulterior del sistema inmune al patógeno o sus sustancias da como resultado 5 una respuesta inmunitaria rápida que anula a dicho patógeno antes de que puedan inducir en el organismo vacunado signos de enfermedad.

La meta de cualquier vacunación es inducir una respuesta inmune potente capaz de proteger el mayor tiempo posible a un organismo frente a una infección.

Adyuvantes A diferencia de lo que ocurre con las vacunas que emplean organismos vivos, las vacunas que emplean los agentes infecciosos muertos o atenuados, los antígenos purificados, o las toxinas requieren del uso de potenciadores de la inmunidad llamados adyuvantes.

El primer adyuvante descrito fue publicado en 1924 por Ramón [Sur la toxine et sur l’anatoxine diphthériques. Ann. Inst. Pasteur, 38, 1-10]. Desde entonces se han utilizado sales de aluminio en la mayoría de las vacunas. Puede encontrarse una revisión de adyuvantes empleados en vacunas en [Vogel FR, Powell MF. A summar y compendium of vaccine adjuvants and excipients. In: Powell MF, Newman MJ, editors. Vaccine design: the subunit and adjuvant approach. New

York: Plenum Publishing. Corp.; 1995. p. 234–250].

La eficacia de una inmunización y de los adyuvantes va a depender del tipo de ruta de administración de la vacuna, ya que no se obtiene la misma respuesta con una inmunización a través de mucosas que con una administración parenteral, así

dependiendo de ésta, el uso de nuevos vectores, sistemas de liberación de los antígenos, y/o adyuvantes dependerá de la ruta elegida.

Los adyuvantes se pueden clasificar en función de su modo de acción o de su naturaleza química o su origen, así tendremos:

-Sistemas de liberación de antígenos: entre los que se encuentran muchos de los adyuvantes tradicionales como alúmina, liposomas, micropartículas; partículas “like-virus”; nano partículas de liberación de antígenos; liposomas; microesferas de polímeros; ISCOMs (nanopartículas formadas por fosfatidil colina, colesterol y Quil A) .

- Potenciadores de la inmunidad:

• Adyuvantes inorgánicos;

• Adyuvantes de origen microbiano o de plantas: LPS (lipopolisacaridos) ; subunidades de toxinas de origen bacteriano (Toxina colérica B) ; Muramil dipeptido; DNA bacteriano; CpGs; o derivados del Lípido A,

como el monofosforillípido A (“MPL”) o derivados químicos. Todos ellos se están probando como adyuvantes en experimentos clínicos.

• Otros adyuvantes son emulsiones oleosas en aceites vegetales o animales, o interleukinas o el ADN que las codifica.

Uno de los adyuvantes más prometedores actualmente lo constituyen lo que se denominan lipopéptidos, compuestos basados en la modificación química de los antígenos a modo de los potenciadores de inmunidad de origen bacteriano unidos a lípidos iguales o similares al lípido A.

El primer trabajo relacionado data de 1984 (Hopp TP. Immunogenicity of a synthetic HBsAg peptide: enhancement by conjugation to a fatty acid carrier. Mol Immunol 1984;

21: 13–16) . En este trabajo se describe un aumento de la respuesta frente a péptidos sintéticos del virus de la influenza administrados junto a dipalmitil-lisina, constituyendo así la estrategia de unir proteínas a cadenas lipofílicas. Otros trabajos posteriores 25 (Schild H, Deres K, Wiesmüller KH, Falk K, Jung G, Rammensee HG. Efficiency of peptide and lipopeptide for in vivo priming of virus-specific cytotoxic T cells. Eur J Immunol 1991; 2: 2649. Deres K, Schild H, Wiesmüller KH, Jung G, Rammensee HG. In vivo priming of virus-specific cytotoxic T lymphocytes with synthetic lipopepide vaccine. Nature 1989; 342: 561–64., Schild H, Norda M, Deres K, et al. Fine specificity 30 of cytotoxic T lymphocytes primed in vivo either with virus or synthetic lipopeptide vaccine or primed in vitro with peptide. J Exp Med 1991; 174:1665–68S) describen como un lipopétido del virus de la influenza desencadenaba una respuesta citotóxica, este hecho aumentó enormemente el uso potencial de los lípidos unidos a proteínas en vacunas. Hasta la fecha existen numerosos estudios en los que sintetizan lipopéptidos o conjugados de proteínas con lípidos induciendo una respuesta CTL similar a cuando se han usado vacunas vivas, evitando así el riesgo que conllevan.

(Br y nestad K, Babbit B, Huang L, Rouse BT. Influence of peptide acylation, liposome incorporation, synthetic immunomodulators on the immunogenicity of a 1-23 peptide of glycoprotein D of herpes simplex virus: implications for subunit vaccines. J Virol 1990;

64: 680–85) . Los mecanismos celulares por los cuales los lipopéptidos provocan esta respuesta tampoco se conocen exactamente, siendo un mecanismo complejo en el que el antígeno unido al lípido interacciona con las células presentadoras de antígeno (APC) . (BenMohamed L, Thomas A, Bossus M, et al. High immunogenicity in chimpanzees of peptides and lipopeptides derived from four new Plasmodium falciparum pre-er y throcytic molecules. Vaccine 2000; 18: 2843–55.) .

Los lipopéptidos activan a los macrófagos desencadenando una respuesta en la que intervienen la IL1, IL6 y el TNF-a. (Rouaix F, Gras-Masse H, Mazingue C, et al. Effect of a lipopeptidic formulation on macrophage activation and peptide presentation to T cells. Vaccine 1994; 12:1209–14) . Una de las ventajas que poseen es que se usan péptidos sintéticos o recombinantes que al formar las micelas con los ácidos grasos protegen a los epítopos frente a las enzimas proteolíticas (BenMohamed L, Thomas A, Bossus M, et al. High immunogenicity in chimpanzees of peptides and lipopeptides derived from four new Plasmodium falciparum pre-er y throcytic molecules. Vaccine 2000; 18: 2843–55.; BenMohamed L, Gras-Masse H, Tartar A, et al. Lipopeptide immunization without adjuvant induces potent and long-lasting B, T helper; and cytotoxic T lymphocytes responses against a malaria liver stage antigen in mice and chimpanzees. Eur J Immunol 1997; 27: 1242–53) de los tejidos y del suero mejorando así la inmunogenicidad del antígeno al ser mejor absorbido por las células APC (Deprez B, Sauzet JP, Boutillon C, et al. Comparative efficiency of simple lipopeptide constructs for in vivo induction of virus-specific CTL. Vaccine 1996; 14: 375–82 ; Tsunoda I, Sette A, Fujinami R, et al. Lipopeptide particles as the immunologically active component of CTL inducing vaccines. Vaccine 1999; 17: 675–85.) . Y en especial el poder ser usados dichos adyuvantes en sistemas de vacunación usando como antígeno... [Seguir leyendo]

1. Uso de un compuesto que comprende un lípido y un grupo vinilsulfona como adyuvante inmunológico.

2. Uso según la reivindicación anterior, donde el compuesto es un compuesto de fórmula general (I) :

(I) donde: Y es un grupo -CH2–SO2R1- o -CH2-; R1 es un radical seleccionado del grupo que comprende un alquilo (C1-C10) , un alquenilo (C1-C10) , un alquinilo (C1-C10) , un dialquilarilo (C1-C10) Ar (C1-C10) o un grupo (CH2CH2O) nCH2CH2; n toma valores de 1 a 20; X es un grupo –CO-NH-R2-Z-CH2-, -Z-CH2- o –CH2-; Z es S ó O; R2 es un radical seleccionado del grupo que comprende un alquilo (C1-C10) , un alquenilo (C1-C10) , un alquinilo (C1-C10) , un dialquilarilo (C1-C10) Ar (C1-C10) ó un grupo (CH2CH2O) mCH2CH2; m toma valores de 1 a 20; y

representa un lípido.

3. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores donde el lípido es un esterol.

4. Uso según la reivindicación anterior, donde el esterol se selecciona de la lista que comprende colesterol, epicolesterol, estigmasterol, lanosterol, ergosterol y coprostenol.

5. Uso según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el lípido es un hidrocarburo alifático (C4-C30) saturado.

6. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el lípido es un hidrocarburo alifático (C4-C30) insaturado.

7. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 5 ó 6, donde el lípido es un hidrocarburo alifático (C10-C20) .

8. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, donde X es un grupo –CO-NH-R2-Z-CH2- y Z se ha definido en la reivindicación 2.

9. Uso según la reivindicación 8 donde R2 es un grupo alquilo (C2-C5) .

10. Uso según la reivindicación 9 donde R2 es un grupo etilo.

11. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7 donde X es el grupo –Z-CH2- y Z se ha definido en la reivindicación 2.

12. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, donde Z es O. 20 13. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11, donde Z es S.

14. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7, donde X es –CH2-.

15. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14, donde el grupo Y es –CH2-.

16. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14, donde R1 es un grupo (CH2CH2O) nCH2CH2 y n toma valores de entre 1 a 10.

17. Uso según la reivindicación 16, donde n toma valores de entre 2 a 5.

18. Uso según la reivindicación 17, donde n es 2.

19. Uso según la reivindicación 1, donde el compuesto es de fórmula (II) :

20. Uso de un compuesto descrito según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, para la fabricación de una vacuna.

21. Uso de un compuesto descrito según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19,

para la fabricación de una vacuna frente a una enfermedad parasitaria, 10 preferiblemente Leishmaniasis.

22. Uso según la reivindicación anterior, donde la vacuna comprende como componente antigénico proteínas Prohibitinas 1 y 2 de Leishmania.

23. Uso según la reivindicación anterior, donde la vacuna es frente a la Leishmaniasis.

24. Una vacuna que comprende el compuesto descrito según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 y un antígeno o componente antigénico.

25. Vacuna según la reivindicación anterior, donde dicha vacuna se encuentra en una forma adecuada para su administración por vía parenteral, oral, a la mucosa, sublingual, transdérmica, tópica, por inhalación, intranasal, en aerosol, intraocular, intratraqueal, intrarrectal, vaginal, por pistola génica, parche dérmico o en forma de gotas oculares o enjuague bucal.

26. Vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 25 o 26, donde el componente antigénico comprende las proteínas Prohibitinas 1 y 2 de Leishmania.

27. Procedimiento de preparación de una vacuna según se describe en las 30 reivindicaciones 24 a 26, que comprende las siguientes etapas:

a. solubilización del adyuvante inmunológico descrito en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19 en alcohol a un pH básico, en un tiempo de incubación que oscila entre los 10 minutos a 24 horas;

b. añadir a la disolución de la etapa (a) el antígeno o la composición antigénica;

c. incubar la mezcla del paso (b) a una temperatura de entre 0 y 37 ºC durante 10 min a 24h;

d. añadir un tampón básico con un aminoácido o sustancia capaz de bloquear los residuos de sulfona que no hubieran reaccionado, a la mezcla incubada de la etapa (c) e incubar durante 2 a 3 horas a una temperatura de entre 4ºC y 40ºC.

Fig. 1

Fig. 2 Fig. 3 Fig. 4 Fig. 5 Fig. 6 Fig. 7

Fig. 8 Fig. 9 Fig. 10 Fig. 11

LISTA DE SECUENCIAS

<110> <120> Universidad de GranadaADYUVANTE INMNULOGICO PARA LA FORMULACION DE VACUNAS Y VACUNA FRENTE A LEISHMANIASIS QUE LO COMPRENDE

<130> IPR-474

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> <211> <212> <213> 1 20 DNA Secuencia Artificial

<220> <223> Cebador HPTR directo

<400> 1 tgctgacctg ctggattaca 20

<210> <211> <212> <213> 2 20 DNA Secuencia Artificial

<220> <223> Cebador HPTR reverso

<400> 2 tatgtccccc gttgactgat 20

<210> <211> <212> <213> 3 20 DNA Secuencia Artificial

<220> <223> Cebador TNF-alfa directo

<400> 3 agcccccagt ctgtatcctt 20

<210> <211> <212> <213> 4 20 DNA Secuencia Artificial

<220> <223> Cebador TNF-alfa reverso

<400> 4 ggtcactgtc ccagcatctt 20

<210> <211> <212> <213> 5 20 DNA Secuencia Artificial

<220> <223> Cebador INF-gamma directo

<400> 5 caccctgaag tcgttgtgaa <210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador INF-gamma reverso <400> 6 cgtcaaaaga cagccactca <210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador TGF-beta directo <400> 7 gtgtggagca acatgtggaa <210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador TGF-beta reverso <400> 8 cgtcaaaaga cagccactca <210> º

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador IL-2 directo <400> º aagctctaca gcggaagcac

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador IL-2 reverso <400> 10 atcctgggga gtttcaggtt

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador IL-4 directo

<400> ttgaacgagg tcacaggaga

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador IL-4 reverso

<400> 12

caccttggaa gccctacaga 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador IL-10 directo

<400> 13

ctgtttccat tggggacact 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador IL-10 reverso

<400> 14

aagtgtggcc agccttagaa 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador IL-12 directo

<400> 15

cctgaagtgt gaagcaccaa 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador IL-12 reverso

<400> 16

tcaggggaac tgctactgct 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador IL-17 directo

<400> 17

ttcagggtcg agaagatgct 20

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial

<220>

<223> Cebador IL-17 reverso

<400> 18

aaacgtgggg gtttcttagg 20