ADN polimerasas mutantes y métodos relacionados.

ADN polimerasa, que comprende A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-S-X6-X7-Q-X8- X9- X10-X11-L-X12-X13-X14X15,

en la que:

X1 es E,

X2 es P,

X3 es N,

X4 es I,

X5 es N,

X6 es P,

X7 es K,

X8 es V,

X9 es S,

X10 es R,

X11 es I,

X12 es F,

X13 es G,

X14 es K, y

X15 es L,

en la que la polimerasa presenta una tasa mejorada de extensión de ácidos nucleicos en comparación con una ADNpolimerasa de otro modo idéntica con la excepción de que X13 es E.

ADN polimerasas mutantes y métodos relacionados

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo de las ADN polimerasas y su utilización en diversas aplicaciones, incluyendo la extensión y amplificación de cebadores de ácidos nucleicos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las ADN polimerasas son responsables de la replicación y mantenimiento del genoma, un papel que es crucial para transmitir de manera fidedigna la información genética de generación en generación. Las ADN polimerasas funcionan en las células como enzimas responsables de la síntesis del ADN. Polimerizan desoxirribonucleósidos trifosfato en presencia de un activador metálico, tal como Mg2+, en un orden dictado por el molde de ADN o el polinucleótido molde que se copia. In vivo, las ADN polimerasas participan en un abanico de procesos sintéticos del ADN, incluyendo la replicación del ADN, la reparación, recombinación y amplificación génica del ADN. Durante cada proceso sintético del ADN, se copia el molde de ADN una vez, o como máximo unas cuantas veces, para producir réplicas idénticas. En contraste, in vitro, la replicación del ADN puede repetirse muchas veces, tal como, por ejemplo, durante la reacción en cadena de la polimerasa (ver, por ejemplo, la patente US nº 4.683.202, de Mullis) .

En los estudios iniciales con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) , se añadió la ADN polimerasa al inicio de cada ronda de replicación del ADN (ver la patente US nº 4.683.202, supra) . Posteriormente, se determinó que las ADN polimerasas termoestables podían obtenerse de bacterias que viven a temperaturas elevadas, y que estos enzimas necesitan añadirse sólo una vez (ver la patente US nº 4.889.818, de Gelfand, y la patente US nº 4.965.188, de Mullis) . A las temperaturas elevadas que se utilizan durante la PCR, estos enzimas no resultan inactivados irreversiblemente. En consecuencia, pueden llevarse a cabo ciclos repetitivos de reacciones en cadena de la polimerasa sin añadir enzimas nuevos al inicio de cada procedimiento de adición sintética. Las ADN polimerasas, particularmente las polimerasas termoestables, son la clave de un gran número de técnicas en los estudios de ADN recombinante y en el diagnóstico médico de las enfermedades. Para las aplicaciones diagnósticas en particular, una secuencia de ácidos nucleicos diana puede ser sólo una parte pequeña del ADN o ARN en cuestión, de manera que puede resultar difícil detectar la presencia de una secuencia diana de ácidos nucleicos sin la amplificación.

El patrón global de plegamiento de las polimerasas es similar al de la mano derecha humana y contiene tres subdominios claros: palma, dedos y pulgar (ver Beese et al., Science 260:352-355, 1993; Patel et al., Biochemistr y

34: 5351-5363, 1995) . Aunque la estructura de los subdominios de los dedos y del pulgar varían mucho entre polimerasas que difieren de tamaño y funciones celulares, todos los subdominios catalíticos de palma son superponibles. Por ejemplo, el motivo A, que interactúa con el flujo de entrada de dNTP y estabiliza el estado de transición durante la catálisis química, es superponible, con una desviación promedio de aproximadamente un Å entre las familias de pol Q de mamífero y pol I procariótica de ADN polimerasas (Wang et al., Cell 89:1087-1099, 1997) . El motivo A se inicia estructuralmente en una cadena º antiparalela que contiene residuos predominantemente hidrofóbicos y continúa en una hélice Q. La secuencia de aminoácidos primaria de los sitios activos de la ADN polimerasa se encuentra excepcionalmente conservada. En el caso del motivo A, por ejemplo, la secuencia DYSQIELR (SEC ID nº 30) se encuentra conservada en las polimerasas de organismos separados por muchos millones de años de evolución, incluyendo, por ejemplo, Thermus aquaticus, Chlamydia trachomatis y Escherichia coli. Conjuntamente, estas observaciones indican que las polimerasas funcionan mediante mecanismos catalíticos similares.

Además de encontrarse bien conservada, también se ha demostrado que el sitio activo de las ADN polimerasas es relativamente mutable, siendo capaz de incluir determinadas sustituciones de aminoácidos sin que se reduzca la actividad de ADN polimerasa significativamente (ver, por ejemplo, la patente US nº 6.602.695, de Patel et al.) . Las ADN polimerasas termoestables que presentan una tasa de extensión elevada (transcripción inversa) derivada de una cepa de arqueobacteria hipertermofílica o que comprenden secuencias de motivo críticas definidas son conocidas (por ejemplo a partir de las patentes EP nº 0 745 675 y nº 1 152 062) . Además, se han descrito diversas ADN polimerasas mutantes definidas que comprenden una renovación catalítica mejorada o una actividad enzimática mejorada en, por ejemplo, los documentos nº WO2005/045015 y nº WO01/051621, respectivamente. Dichas ADN polimerasas mutantes pueden proporcionar diversas ventajas selectivas en, por ejemplo, aplicaciones diagnósticas y de investigación que comprenden reacciones de síntesis de ácidos nucleicos. La presente invención, tal como se describe en la presente memoria, cumple dichas y otras necesidades.

BREVE DESCRIPCIÓN RESUMIDA DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona ADN polimerasas que presentan una actividad enzimática mejorada respecto a la polimerasa no modificada correspondiente y que resulta útil en una diversidad de aplicaciones de síntesis de ácidos

nucleicos. En algunas realizaciones, se aíslan o se purifican las polimerasas. La ADN polimerasa de la invención comprende la secuencia de aminoácidos A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-S-X6-X7-Q-X8- X9- X10-X11-L-X12-X13-X14X15, en la que:

X1 es E, X2 es P, X3 es N, X4 es I, X5 es N, X6 es P, X7 es K, X8 es V, X9 es S, X10 es R, X11 es I, X12 es F, X13 es G, X14 es K, y X15 es L;

en la que la polimerasa presenta una tasa de extensión de ácidos nucleicos mejorada respecto a una ADN polimerasa de otro modo idéntica en la que X13 es E. La polimerasa mutante presenta G en la posición X13 (SEC ID nº 33) .

Las ADN polimerasas de la invención se refieren a ADN polimerasas que son versiones modificadas de una polimerasa no modificada. En la forma no modificada, la polimerasa generalmente es funcional, presentando actividad de incorporación de nucleótidos, e incluye una secuencia de aminoácidos que presenta el motivo siguiente en el dominio polimerasa:

A-G-X1-x2-F-X3-X4-X5-S-X6-X7-Q-X8-X9-X10-X11-L-X12-X13-X14-X15 (SEC ID nº 29) ; en la que X2, X5, X6, X9 y X10 son cualquier aminoácido; X1 es H, E o Q; X3 es N o H; X4 es L o I; X7 es D, K o T; X8 es L o V; X11 es V, I o L; X12 es F

o Y; X13 es D o E; X14 es K o E; X15 es L o Q.

La polimerasa mutante (es decir, modificada a partir de SEC ID nº 29) se caracteriza adicionalmente porque incluye una sustitución de aminoácido respecto a la forma no modificada, por lo menos en la posición X13, y porque presenta una tasa de extensión de ácidos nucleicos mejorada respecto a la forma no modificada. La polimerasa mutante presenta un aminoácido diferente de D o E en la posición X13, en particular la polimerasa mutante presenta G en la posición X13.

Diversas ADN polimerasas se prestan a mutación según la presente invención. Resultan particularmente adecuadas las polimerasas termoestables, incluyendo las polimerasas termoestables de tipo salvaje o naturales de diversas especies de bacterias termofílicas, así como polimerasas termoestables derivadas de dichos enzimas de tipo salvaje o naturales mediante sustitución, inserción o deleción de aminoácidos u otra modificación. Entre las formas no modificadas ejemplares de polimerasa se incluyen, por ejemplo, la ADN polimerasa CS5 ó CS6, o una ADN polimerasa funcional que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 80%, 85%, 90% ó 95% respecto a la misma. Entre otras polimerasas no modificadas se incluyen, por ejemplo, las ADN polimerasas de cualquiera de las especies siguientes de bacterias termofílicas (o una ADN polimerasa funcional que presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a dicha polimerasa) : Thermotoga maritima, Thermus aquaticus, Thermus thermophilus, Thermus flavus, Thermus filiformis, Thermus sp. sps17, Thermus sp. Z05, Thermotoga neopolitana, Thermosipho africanus, Thermus caldophilus o Bacillus caldotenax. Entre las polimerasas adecuadas también se incluyen aquéllas que presentan actividad de transcriptasa inversa (RT) y/o la capacidad de incorporar nucleótidos no convencionales, tales como ribonucleótidos u otros nucleótidos modificados en la posición 2'.

En algunas realizaciones, la forma no modificada de la polimerasa comprende una polimerasa quimérica. Según la invención, la forma no modificada... [Seguir leyendo]

1. ADN polimerasa, que comprende A-G-X1-X2-F-X3-X4-X5-S-X6-X7-Q-X8- X9- X10-X11-L-X12-X13-X14X15, en la que:

X1 es E, X2 es P, X3 es N, X4 es I, X5 es N, X6 es P, X7 es K, X8 es V, X9 es S, X10 es R, X11 es I, X12 es F, X13 es G, X14 es K, y X15 es L,

en la que la polimerasa presenta una tasa mejorada de extensión de ácidos nucleicos en comparación con una ADN polimerasa de otro modo idéntica con la excepción de que X13 es E.

2. ADN polimerasa según la reivindicación 1, en la que la polimerasa comprende una polimerasa quimérica.

3. ADN polimerasa según la reivindicación 2, en la que la polimerasa quimérica presenta una identidad de secuencia de por lo menos 90% respecto a una ADN polimerasa CS5 (SEC ID nº 20) o la ADN polimerasa CS6 (SEC ID nº 21) .

4. ADN polimerasa según la reivindicación 4, en la que la polimerasa quimérica comprende SEC ID nº 20 ó SEC ID nº 21 ó una o más sustituciones de aminoácidos respecto a SEC ID nº 20 ó SEC ID nº 21, las cuales se seleccionan de entre el grupo que consiste de: G46E, L329A y E678G, e incluye un cambio E558G respecto a SEC ID nº 20 ó SEC ID nº 21.

5. ADN polimerasa según la reivindicación 1, que comprende además una modificación covalente térmicamente reversible.

6. Ácido nucleico recombinante que codifica la ADN polimerasa según la reivindicación 1.

7. Vector de expresión que comprende el ácido nucleico recombinante según la reivindicación 6.

8. Célula huésped que comprende el vector de expresión según la reivindicación 7.

9. Método para producir una ADN polimerasa, comprendiendo dicho método:

cultivar la célula huésped según la reivindicación 8 bajo condiciones adecuadas para la expresión del ácido nucleico codificante de la ADN polimerasa mutante.

10. Método para llevar a cabo la extensión de cebadores, que comprende:

poner en contacto una ADN polimerasa según la reivindicación 1 con un cebador, un polinucleótido molde y nucleótidos libres bajo condiciones adecuadas para la extensión del cebador, produciendo de esta manera un cebador extendido.

11. Método según la reivindicación 10, en el que el polinucleótido molde es un ARN o un ADN.

12. Método según la reivindicación 10, en el que los nucleótidos libres comprenden nucleótidos no convencionales, comprendiendo estos últimos ribonucleótidos o nucleótidos marcados.

13. Método según la reivindicación 10, que comprende poner en contacto la ADN polimerasa con una pareja de cebadores, el polinucleótido molde y los nucleótidos libres bajo condiciones adecuadas para la amplificación del polinucleótido.

14. Kit para producir un cebador extendido, que comprende:

por lo menos un recipiente que proporciona una ADN polimerasa según la reivindicación 1 y uno o más recipientes adicionales seleccionados de entre el grupo que consiste de:

(a) un recipiente que proporciona un cebador hibridable, bajo condiciones de extensión de cebadores, con un polinucleótido molde predeterminado,

(b) un recipiente que proporciona nucleótidos libres, y

(c) un recipiente que proporciona un tampón adecuado para la extensión de cebadores.