Procedimiento para acumular producto de gen exógeno a una concentración alta en semillas de plantas.

Un procedimiento para acumular producto de un gen exógeno en semillas de plantas,

que comprende las etapasde: introducir un vector que comprende un gen exógeno en una planta mutante que es defectiva en proteína dealmacenamiento de semillas endógena y expresar el gen exógeno en la planta, en el que dicho vector comprende un gen exógeno unido de forma funcional corriente abajo de un promotor que garantiza la expresión del gen exógenoen las semillas de la planta, y una región no traducida en 5' completa de un gen que codifica una proteína dealmacenamiento de semillas seleccionada del grupo que consiste en glutelina, globulina, prolamina y albúmina, queestá insertada entre el promotor y el gen exógeno, y en el que la etapa de introducción del vector no comprendecruce sexual.

Procedimiento para acumular producto de gen exógeno a una concentración alta en semillas de plantas

Campo técnico

La presente invención se refiere a un procedimiento para acumular concentraciones altas de producto de un gen exógeno en semillas de plantas.

Técnica anterior

Las proteínas de almacenamiento de semillas se clasifican, convencionalmente, en cuatro grupos de proteínas, de acuerdo con su solubilidad, es decir, glutelinas, globulinas, prolaminas y albúminas. El arroz es diferente de otros cereales, tales como el trigo y el maíz, en cuanto que la glutelina es la principal proteína de almacenamiento de semillas, representando aproximadamente del 70 al 80 % de las proteínas de almacenamiento de semillas. El grupo de genes de glutelina comprende aproximadamente 10 genes por un genoma haploide, y los genes se dividen en dos subfamilias, GluA y GluB, que muestran una homología del 60 al 65 % en la secuencia de aminoácidos dentro de la región codificante. Cada subfamilia comprende aproximadamente 5 genes que tienen una homología del 80 %

o mayor en la secuencia de aminoácidos. Un gen de glutelina se expresa específicamente y se acumula en el endospermo. La especificidad de tejido de la expresión de la glutelina está regulada de forma considerablemente estricta y las glutelinas no se expresan en otros tejidos, tales como la hoja y la raíz. En general, la expresión del grupo de genes de glutelina, con la excepción del GluA-3, es coordinada; sus niveles de ARNm muestran el siguiente patrón: emergencia 5 días después de la floración (día 5) , alcance del máximo alrededor del día 15 y disminución después de esto. El gen GluB-1 tiene la actividad promotora más fuerte del grupo de genes de glutelina.

Se han aislado mutantes de arroz con disminución de la cantidad acumulada de glutelina, es decir, la principal proteína de almacenamiento de semillas. Por ejemplo, Iida et al. aislaron mutantes recesivos que carecen de cualquiera de las subunidades ácidas de la glutelina, α1, α2 o α3, a partir de una variedad de arroz Koshihikari que se irradió con rayos γ. Los fenotipos están regulados, respectivamente, por un único gen recesivo (es decir, glu1, glu2 o glu3) . También se ha obtenido una cepa mutante (α123) que carece de todas las α1, α2 y α3 cruzando los tres mutantes anteriores (Iida, S. et al., Theor. Appl. Genet. 94: 177-183 (1997) ) .

El LGC-1 (bajo contenido en glutelina-1 es un mutante seleccionado de Nihonmasari tratado con EMS y tiene un fenotipo con una concentración de glutelina significativamente disminuida (Iida, S. et al., Theor. Appl. Genet. 87: 374378 (1993) ) . El LGC-1 se caracteriza además por concentraciones aumentadas de prolamina y globulina. El LGC-1 está dominado por un único gen dominante. Mediante el mapeo de los genes defectivos en LGC-1 y los mutantes defectivos en α1, α2 y α3, se reveló que el gen de proteína mutado (lgc-1) de LGC-1 y el gen de glutelina mutado (glu1) del mutante que carece de α1 están situados en el mismo locus. Los resultados de la hibridación de Southern usando el gen de glutelina (GluB) como sonda indicaron que el LGC-1 contenía una mutación en el gen GluB o próxima al mismo. De acuerdo con los resultados de los análisis de transferencia de bandas Northern, comparando el nivel de expresión del gen GluB en el endospermo después de aproximadamente 16 días desde la germinación principal en LGC-1 y su variedad original, Nihonmasari, se reveló que la expresión de GluB está considerablemente disminuida en LGC-1.

En la soja, se conoce la glicinina como proteína de almacenamiento de semillas. La glicinina se produce como un polipéptido precursor de un tamaño de aproximadamente 60 kDa en el que están unidos juntos un péptido señal, un polipéptido ácido y un polipéptido básico; el péptido señal se escinde posteriormente. Después de esto, se forma una subunidad en la que dos tipos de polipéptidos resultantes de una escisión en el sitio Asn-Gly, es decir, el polipéptido ácido (A) y el polipéptido básico (B) específicos, se polimerizan a través de enlaces disulfuro. Seis de estas subunidades se ensamblan para formar un hexámero y se almacenan en el cuerpo de la proteína (PB) . El hexámero también se denomina "proteína de almacenamiento de semillas 11S", debido a su coeficiente de sedimentación (11S) . Las subunidades de la glicinina se clasifican en el grupo I y el grupo II, basándose en la estructura primaria de sus ADNc y su homología de secuencia de aminoácidos. Hasta la fecha, se conocen las subunidades AlaB1b, A1bB2 y A2B1a del grupo I y las subunidades A3B4 y A5A4B3 del grupo II. Se sabe que seis de estas subunidades se combinan casi aleatoriamente en la glicinina de soja. Además, se ha informado de que un péptido derivado de la subunidad A1aB1b de la glicinina de soja tiene la capacidad de unirse a ácido biliar (Shio Makino, The Food Industr y 39 (24) : 77-87 (1996) ) , lo que indica que la capacidad de las proteínas de soja de hacer disminuir la concentración de colesterol en sangre depende de la subunidad AlaB1b.

Momma, K. et al. (Biosci. Biotechnol. Biochem. 63:314-318, 1999) analizaron arroz transformado con el gen de la glicinina de soja y descubrieron que tenía un contenido proteico aumentado como consecuencia de la expresión de la glicinina de soja.

Goossens, A. et al. (FEBS Letter 456:160-164, 1999) divulga la expresión potenciada de un transgén (Arc5) por la inducción simultánea de un gen antisentido para una proteína de almacenamiento de semillas endógena (albúmina 2S) en una planta natural que no es defectiva en ninguna proteína de almacenamiento de semillas endógena.

Takaiwa, F. et al. (Plant Sci. 111:39-49, 1995) divulga un vector que tiene una región no traducida en 5' de glicinina/glutelina quimérica para su inserción en una planta de tabaco para la producción de glicinina. Asimismo, Katsube, T. et al. (Plant Physiol. 120:1063-1073, 1999) han usado el mismo gen quimérico para sus experimentos en arroz transgénico.

El propio gen de glutelina de arroz se conoce a partir del N.º de acc. X54314 del EMBL.

Se conocen mutantes de arroz defectivos en proteínas de almacenamiento de semillas a partir de Iida, S. et al., (Theor. Appl. Genet. 94: 177-183, 1997) , quienes describen nueve líneas mutantes que carecen de subunidades de glutelina debido a una mutación en sus genes de glutelina.

Divulgación de la invención Los presentes inventores se centraron en las funciones fisiológicas beneficiosas de la glicinina de soja, tales como el efecto de disminución del colesterol descrito anteriormente, y ya han tenido éxito en la generación de arroz en el que se ha modificado la composición de proteínas de almacenamiento de las semillas expresando el gen A1aB1b en el endospermo de las semillas de arroz (en la patente N.º 3030339) . No obstante, para que surja un efecto de función fisiológica deseado de la ingesta del arroz, se necesitan niveles de expresión mayores. En consecuencia, es necesario desarrollar y utilizar técnicas que permitan la acumulación de concentraciones mayores de producto de gen exógeno en el arroz. La presente invención se llevó a cabo teniendo en cuenta este requisito y su objetivo es proporcionar un procedimiento para acumular concentraciones altas de producto de gen exógeno en semillas de plantas.

Con el fin de conseguir el objetivo anterior, los presentes inventores intentaron mejorar el promotor para expresar niveles altos de un gen exógeno en semillas de plantas. Examinando la región promotora del gen GluB-1 de la proteína de almacenamiento de semillas glutelina del arroz, se reveló que los vectores convencionales usados para expresar el gen de la glicina contenían de forma incompleta la región no traducida en 5' del gen de la glutelina. Los presentes inventores se centraron en la región no traducida en 5' del gen de la glutelina, cuya importancia no se ha reconocido aún, y estudiaron si la inserción de la región no traducida en 5' en vectores de expresión mejoraría el nivel de acumulación de ARNm. Los resultados no mostraron ninguna mejora en el nivel de expresión en comparación con el transductante del gen de glicinina convencional asociado con la inserción de una secuencia potenciadora de un gen de la fotosíntesis del tabaco entre el promotor del gen GluB-1 y el gen de la glicina (A1aB1b) (pSaDb) . Sin embargo, la inserción de la región no traducida en 5' completa de la glutelina (ATG) hizo aumentar de forma espectacular los niveles de acumulación tanto de ARNm como de proteína.

Los estudios anteriores nunca tuvieron en cuenta la capacidad máxima de expresión génica (transcripción y traducción) en la... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para acumular producto de un gen exógeno en semillas de plantas, que comprende las etapas de: introducir un vector que comprende un gen exógeno en una planta mutante que es defectiva en proteína de almacenamiento de semillas endógena y expresar el gen exógeno en la planta, en el que dicho vector comprende un gen exógeno unido de forma funcional corriente abajo de un promotor que garantiza la expresión del gen exógeno en las semillas de la planta, y una región no traducida en 5' completa de un gen que codifica una proteína de almacenamiento de semillas seleccionada del grupo que consiste en glutelina, globulina, prolamina y albúmina, que está insertada entre el promotor y el gen exógeno, y en el que la etapa de introducción del vector no comprende cruce sexual.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 en el que la región no traducida en 5' comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que la proteína de almacenamiento de semillas defectiva en la planta está seleccionada del grupo que consiste en glutelina, globulina, prolamina y albúmina.

4. Una célula de planta transformada derivada de una planta mutante que es defectiva en proteína de almacenamiento de semillas endógena en la que se ha introducido un vector que comprende un gen exógeno, en la que dicho vector comprende un gen exógeno unido de forma funcional corriente abajo de un promotor que garantiza la expresión del gen exógeno en semillas de plantas, y una región no traducida en 5' completa de un gen que codifica una proteína de almacenamiento de semillas seleccionada del grupo que consiste en glutelina, globulina, prolamina y albúmina, que está insertada entre el promotor y el gen exógeno.

5. La célula de planta transformada de acuerdo con la reivindicación 4, en la que la región no traducida en 5' comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.

6. La célula de planta transformada de acuerdo con la reivindicación 4 o 5, en la que la proteína de almacenamiento de semillas defectiva en la planta es una proteína seleccionada del grupo que consiste en glutelina, globulina, prolamina y albúmina.

7. Una planta transgénica que comprende la célula de planta transformada de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6.

8. Un vector que comprende un gen exógeno unido de forma funcional corriente abajo de un promotor que garantiza la expresión del gen exógeno en semillas de plantas y una región no traducida en 5' completa de un gen que codifica una proteína de almacenamiento de semillas seleccionada del grupo que consiste en glutelina, globulina, prolamina; que está insertada entre el promotor y el gen exógeno.

9. El vector de acuerdo con la reivindicación 8, en el que la región no traducida en 5' del gen de la glutelina comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 1.

10. El vector de acuerdo con la reivindicación 8 o 9, en el que el promotor que garantiza la expresión en semillas de plantas es un promotor de un gen que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en glutelina, globulina, prolamina y albúmina.

11. Una célula de planta transformada en la que se introduce el vector de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10.

12. Una planta transgénica que comprende la célula de planta transformada de acuerdo con la reivindicación 11.

13. Una planta transgénica que es una progenie o clon de la planta transformada de acuerdo con la reivindicación 7

o 12 y que comprende un gen exógeno unido de forma funcional corriente abajo de un promotor que garantiza la expresión del gen exógeno en semillas de plantas, y una región no traducida en 5' completa de un gen que codifica una proteína de almacenamiento de semillas seleccionada del grupo que consiste en glutelina, globulina, prolamina y albúmina, que está insertada entre el promotor y el gen exógeno.

14. Un material de cultivo de la planta transgénica de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7, 12 o 13 y que comprende un gen exógeno unido de forma funcional corriente abajo de un promotor que garantiza la expresión del gen exógeno en semillas de plantas, y una región no traducida en 5' completa de un gen que codifica una proteína de almacenamiento de semillas seleccionada del grupo que consiste en glutelina, globulina, prolamina y albúmina, que está insertada entre el promotor y el gen exógeno.