Activación y expansión de células.

Un método para expandir una población de células T mediante la ligación de una porción de superficie celular,

que comprende:

a. proporcionar una población de células;

b. poner en contacto dicha población de células con una superficie, en donde dicha superficie tiene unido a ella un primer agente que liga una primera porción de la superficie de la célula T y un segundo agente que liga una segunda porción de la superficie de la célula T, en donde dicha ligación por el primer y segundo agente induce la proliferación de dichas células T y en donde dicho primer agente es un anticuerpo anti-CD3 o un fragmento de anticuerpo de este, y dicho segundo agente es un anticuerpo anti-CD28 o un fragmento de este;

c. expandir dichas células en un sistema cerrado, en donde dichas células se expanden a una concentración de entre 6 x 106 células/ml y 90 x 106 células/ml en menos de dos semanas,

en donde dicho sistema de cierre comprende un biorreactor como recipiente de cultivo posicionado sobre una plataforma oscilante, en donde dicha plataforma oscilante se inicia aproximadamente en el día 3 a aproximadamente 5 a 15 oscilaciones/minuto y en donde la velocidad y el ángulo de dicha plataforma oscilante son variables.

Activación y expansión de células.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Campo de la invención La presente invención se refiere generalmente a métodos para estimular y activar células, y más particularmente, a métodos para activar y expandir las células a densidades muy altas y para expandir las células a números muy altos.

Descripción de la técnica relacionada El receptor de antígeno de la célula T (TCR) es un receptor multisubunitario de reconocimiento que se asocia con el complejo CD3 y se une a péptidos presentados por las proteínas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) clase I y II en la superficie de las células presentadoras de antígeno (APC) . La unión del TCR al péptido antigénico en la APC es el evento central en la activación de células T, que se produce en una sinapsis inmunológica en el punto de contacto entre la célula T y la APC.

Para mantener la- activación de las células T, los linfocitos T típicamente requieren una segunda señal coestimuladora. La coestimulación es típicamente necesaria para que una célula T auxiliadora produzca suficientes niveles de citocinas que induzcan la expansión clonal. Bretscher, Immuno/. Today 13: 74, 1992; June y otros, Immunol. Today 15:321, 1994. La principal señal co-estimuladora se produce cuando un miembro de los ligandos de la familia B7 (CD80 (B7.1) o CD86 (B7.2) ) en una célula presentadora de antígeno activada (APC) se une a CD28 en una célula T.

Los métodos de estimulación de la expansión de ciertos subconjuntos- de células T tienen el potencial de generar una variedad de composiciones de células T útiles en la inmunoterapia. La inmunoterapia exitosa puede ayudarse aumentando la reactividad y la cantidad de las células T por estimulación eficiente.

Las diversas técnicas disponibles para la expansión de- las células T humanas se han basado principalmente en el uso de células accesorias y/o factores de crecimiento exógenos, tales como la interleucina-2 (IL-2) . La IL-2 se ha usado junto con un anticuerpo anti-CD3 para estimular la proliferación de células T, expandiendo predominantemente la subpoblación de células T CD8+. Se cree que se requieren ambas señales de APC para la activación óptima de células T, la expansión, y la sobrevivencia a largo plazo de las células T después de la reinfusión. El requisito de las APC pareadas a MHC como células accesorias presenta un problema importante para los sistemas de cultivo a largo plazo debido a que las APC son relativamente de corta duración. Por lo tanto, en un sistema de cultivo a largo plazo, las APC deben obtenerse continuamente a partir de una fuente y reponerse. La necesidad de un suministro renovable de células accesorias es problemático para el tratamiento de inmunodeficiencias en las que están afectadas las células accesorias. Adicionalmente, cuando se trata una infección viral, si las células accesorias llevan el virus, las células pueden contaminar la población entera de células T durante el cultivo a largo plazo.

En ausencia de factores de crecimiento exógenos o de células accesorias, puede enviarse una señal coestimuladora a una población de células T, por ejemplo, exponiendo las células a un ligando CD3 y a un ligando CD28 unido a una superficie de fase sólida, tal como una perla. Ver C. June, y otros (patente de los Estados Unidos núm. 5, 858, 358) ; C. June y otros WO 99/953823. Si bien estos métodos son capaces de alcanzar poblaciones terapéuticamente útiles de células T, el aumento de robustez y la facilidad de preparación de células T continúan siendo menos que ideales.

Adicionalmente, los métodos actualmente disponibles en la técnica no se han centrado en la expansión a corto plazo de las células T o la obtención de una población más robusta de células T y los resultados beneficiosos de estas. Además, la aplicabilidad de las células T expandidas se ha limitado solamente a pocos estados de enfermedad. Para una máxima efectividad in vivo, teóricamente, una población de células T activadas, generadas ex vivo o in vivo debe estar en un estado que pueda orquestar al máximo una respuesta inmune al cáncer, enfermedad infecciosa, u otros estados de enfermedad. La presente invención proporciona métodos para generar un mayor número de células más puras y altamente activadas que tienen receptor de superficie y características de producción de citocinas que parecen más sanos y naturales que otros métodos de expansión.

Adicionalmente, la presente invención proporciona composiciones de poblaciones celulares de cualquier célula diana, que incluyen las poblaciones de células T y los parámetros para la producción de las mismas, así como también para proporcionar otras ventajas relacionadas.

BREVE RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención proporciona métodos para activar y expandir una población de células T mediante la ligación de una porción de superficie celular, que comprende: a ) una población de células; b. poner en contacto dicha población de células con una superficie, en donde dicha superficie tiene unida a ella un primer agente que liga una primera porción de superficie de la célula T y un segundo agente que liga una segunda porción de superficie de la célula T, en donde dicha ligación por el primer y segundo agente induce la proliferación de dichas células T y en donde dicho primer agente es un anticuerpo anti-CD3 o un fragmento de anticuerpo de este, y dicho segundo agente es un anticuerpo anti-CD28 o un fragmento de este, c. expandir dichas células en un sistema cerrado, en donde dichas células se expanden a una concentración de entre 6 x 106 células/ml y 90 x 106 células/ml en menos de dos semanas, en donde dicho sistema cerrado comprende un recipiente de cultivo biorreactor posicionado en una plataforma oscilante, en donde la oscilación de dicha plataforma se inicia en aproximadamente el día 3 a aproximadamente 5 a 15 oscilaciones/minuto y en donde la velocidad y el ángulo de dicha plataforma oscilante son variables. En una modalidad, las células T se derivan de un único individuo y las células T se expanden a partir de un número de células de partida de aproximadamente 100-500 X 106 hasta un total de aproximadamente 100-500 X 109 células en menos de aproximadamente dos semanas. El método de la reivindicación 1 en donde dichas células T alcanzan una concentración de aproximadamente 50 X 106 células/ml en menos de dos semanas. En una modalidad, las células T alcanzan una concentración de 40-60 X 106 células/ml del día 7 al día 12. En una modalidad adicional, las células T se expanden por lo menos aproximadamente 1.5 veces en aproximadamente 24 horas desde aproximadamente el día 5 a aproximadamente el día 12. En otra modalidad, la población de células T se siembra en un recipiente de cultivo que retiene de aproximadamente un volumen de 0.1 litros a aproximadamente un volumen de 200 litros. En una modalidad relacionada, el recipiente de cultivo comprende al menos un filtro de entrada y un filtro de salida. En aún otra modalidad, la población de células T se siembra a una concentración inicial de 0.2 X 106células/ml a 5 X 106 células/ml.

En una modalidad, la expansión de las células de la presente invención se produce en un sistema cerrado. En una modalidad, el sistema cerrado comprende un recipiente que comprende al menos un filtro de entrada, un filtro de salida, y un puerto de muestreo. En otra modalidad, el medio de cultivo se perfunde a través del sistema cerrado. En ciertas modalidades, la perfusión se inicia aproximadamente en los días 4-8 a una velocidad de aproximadamente 0.5 ml/minuto a aproximadamente 3 ml/minuto. Los medios ilustrativos incluyen, pero sin limitarse a, RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15, y X-Vivo 20. En modalidades adicionales, el medio puede comprender una citocina, tal como IL-2, IFN-γ, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-12, TGFβ, y TNF-α, o una vitamina. En modalidades adicionales, el medio comprende surfactante, un anticuerpo, plasmanato o un agente reductor (por ejemplo, N-acetil-cisteína, 2-mercaptoetanol) .

En otras modalidades, la plataforma comprende además un elemento térmico variable, un imán, y un distribuidor de gas. En ciertas modalidades, el sistema cerrado comprende además una bomba de jeringa y un control para la transferencia estéril hacia y desde dicho sistema cerrado.

La presente invención proporciona además las poblaciones de células T producidas de acuerdo con los métodos descritos en la presente invención.

Otro aspecto de la presente invención describe métodos para la expansión de una población de células mediante la ligación de una porción de superficie celular, que comprende: proporcionar una población... [Seguir leyendo]

1. Un método para expandir una población de células T mediante la ligación de una porción de superficie celular, que comprende:

a. proporcionar una población de células;

b. poner en contacto dicha población de células con una superficie, en donde dicha superficie tiene unido a ella un primer agente que liga una primera porción de la superficie de la célula T y un segundo agente que liga una segunda porción de la superficie de la célula T, en donde dicha ligación por el primer y segundo agente induce la proliferación de dichas células T y en donde dicho primer agente es un anticuerpo anti-CD3 o un fragmento de anticuerpo de este, y dicho segundo agente es un anticuerpo anti-CD28 o un fragmento de este;

c. expandir dichas células en un sistema cerrado, en donde dichas células se expanden a una concentración de entre 6 x 106 células/ml y 90 x 106 células/ml en menos de dos semanas,

en donde dicho sistema de cierre comprende un biorreactor como recipiente de cultivo posicionado sobre una plataforma oscilante, en donde dicha plataforma oscilante se inicia aproximadamente en el día 3 a aproximadamente 5 a 15 oscilaciones/minuto y en donde la velocidad y el ángulo de dicha plataforma oscilante son variables.

2. El método de la reivindicación 1, en donde dichas células T se derivan de un único individuo y en donde dichas células T se expanden a partir de un número de partida d.

10. 500 x 106 células hasta un total d.

10. 500 x 109 células en menos de dos semanas.

3. El método de la reivindicación 2, en donde dichas células T alcanzan una concentración de 50 x 106 células/ml en menos de dos semanas.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, en donde dichas células T alcanzan una concentración d.

4. 80 x 106 células/ml hacia el día 12.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, en donde dichas células T alcanzan una concentración d.

4. 80 x 106 células/ml hacia el día 9.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, en donde dichas células T alcanzan una concentración d.

4. 80 x 106 células/ml hacia el día 7.

7. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2 o 3, en donde dichas células T se expanden en al menos aproximadamente 1.5 veces en aproximadamente 24 horas de aproximadamente el día 5 a aproximadamente el día 12.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 2 a la 7, en donde dicha población de células T se siembra en un recipiente de cultivo que retiene un volumen de aproximadamente 0.1 litros a aproximadamente 200 litros.

9. El método de la reivindicación 8, en donde dicho recipiente de cultivo comprende al menos un filtro de entrada y un filtro de salida.

10. El método de la reivindicación 8, en donde dicha población de células T se siembra a una concentración inicial de 0.1-0.5 x 106 células/ml.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 10, en donde dicho sistema cerrado comprende un recipiente que comprende al menos un filtro de entrada, un filtro de salida, y un puerto de muestreo.

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 11, en donde el medio de cultivo se perfunde a través de dicho sistema cerrado.

13. El método de la reivindicación 12, en donde dicha perfusión se inicia a una velocidad de 0.5 ml/minuto a 3.0ml/minuto el día 4, el día 6 o el día 8.

14. El método de la reivindicación 12, en donde dicho medio se selecciona del grupo que consiste de RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15, y X-Vivo 20.

15. El método de la reivindicación 12, en donde dicho medio de cultivo comprende uno o más de los siguientes: una citocina, una vitamina, un surfactante, un anticuerpo, plasmanato o un agente reductor.

16. El método de la reivindicación 15, en donde dicha citocina se selecciona del grupo que consiste de IL-2, IFN-γ, IL-4, GM-CSF, IL-10, IL-12, TGF-β, y TNF-α.

17. El método de la reivindicación 15, en donde dicho agente reductor se selecciona del grupo que consiste de 5 N-acetil-cisteína y 2-mercaptoetanol.

18. El método de las reivindicaciones 1 a la 10, en donde dicha plataforma comprende además un elemento térmico variable y/o un imán.

19. El método de cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho sistema cerrado comprende además un distribuidor de gas y/o una bomba de jeringa y un control para la transferencia estéril hacia y desde dicho sistema cerrado.

20. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 19, en donde la superficie se selecciona a partir de 15 metales, vidrio, plásticos, co-polímeros, coloides, lípidos, superficies celulares, o una partícula.

21. El método de la reivindicación 20, en donde dicha partícula es paramagnética.

22. El método de la reivindicación 20 o la reivindicación 21, en donde dicha partícula es una perla.