PROCEDIMIENTO DE ACILACIÓN PARA LA OBTENCIÓN DE COMPUESTOS DE INTERÉS ALIMENTICIO Y/O FARMACÉUTICO UTILIZANDO ESTEROL ESTERASAS FÚNGICAS.

Procedimiento de acilación para la obtención de compuestos de interés alimenticio y/o farmacéutico utilizando esterol esterasas fúngicas.

Procedimiento de acilación de fitosteroles libres o de derivados saturados de éstos con ácidos grasos catalizado por una enzima esterol esterasa, caracterizado porque comprende una reacción de acilación en presencia de una esterol esterasa producida por hongos del género Ophiostoma, preferentemente de la especie O. piceae. Ésteres de fitoesteroles o de los derivados saturados de éstos obtenidos por el procedimiento descrito. Un producto enriquecido con los ésteres de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos de la invención, elegido entre un alimento, un preparado alimenticio, un suplemento dietético y un medicamento. Así como el uso de cualquiera de estos productos para reducir los niveles de colesterol en plasma sanguíneo.

Procedimiento de acilación para la obtención de compuestos de interés alimenticio V/o farmacéutico utilizando esterol esterasas fúngicas SECTOR DE LA TÉCNICA

La invención va dirigida principalmente al sector de la industria alimentaria, aunque también al sector de la industria nutracéutica, recientemente denominado "nutracéutica médica". Utilizando la invención descrita es posible: i) sintetizar ésteres de esteroles vegetales (fitosteroles) o de los derivados saturados de éstos (fitostanoles) mediante reacciones de acilación de fitosteroles o fitostanoles respectivamente con ácidos grasos, ii) mejorar las propiedades de productos previamente existentes (como los fitosteroles o los fitostanoles libres) al acilarlos para incorporarlos a alimentos, iii) contribuir a la prevención de la aterosclerosis gracias al papel regulador de la absorción del colesterol de los ésteres de fitosteroles y los ésteres de fitostanoles, y iv) introducir un proceso biotecnológico y más concretamente un biocatalizador (enzima) para la síntesis de estos compuestos.

ESTADO DE LA TÉCNICA

El ritmo de vida actual con tendencia al sedentarismo y el aumento en el consumo de grasas saturadas ha provocado que una gran parte de la población presente niveles de colesterol en suero elevados, facilitando el desarrollo de aterosclerosis, y aumentando, por ello, las probabilidades de sufrir isquemias. A esto hay que unirle aquéllas personas que presentan deficiencias a nivel del metabolismo del colesterol y padecen hipercolesterolemia. Según la Fundación Española del Corazón, desde el 1 de enero hasta el 2 de marzo de 2011 se habrían producido en el mundo 2.839.348 muertes por fallo cardiovascular. Aunque no especifican cuántas habrían sido por accidentes cerebrovasculares o ataques agudos de miocardio es fácil suponer que, en un alto porcentaje de los casos, los fallecimientos habrían sido causados por niveles altos de colesterol. Es por todo esto que el exceso de colesterol se puede considerar como una auténtica pandemia que ya en el año 2.002 causó unos 4, 4 millones de muertes según la OMS.

Los esteroles vegetales o fitosteroles, y por extensión sus derivados saturados los fitostanoles, tienen una estructura química común a la del colesterol, derivando del núcleo de ciclopentanoperhidrofenantreno. Sin embargo, estudios realizados en la última década han (lipoproteína de baja densidad) disminuyendo la probabilidad de desarrollar placas de ate roma. Aunque no se conoce en su totalidad su mecanismo de acción, algunos estudios ponen de manifiesto que podrían reducir la absorción de colesterol en el intestino, al desplazarlo de las micelas digestivas.

Por tanto, el consumo de fitosteroles y fitostanoles podría amortiguar y ayudar a prevenir los niveles altos de colesterol en la población pero al no ser sintetizados por el organismo, han de ser incorporados en la dieta, mediante la ingestión de frutas y vegetales o de productos enriquecidos en ellos (Chen et al. Cholesterol-Iowering nutraceuticals and functional foods. Journal of Agricultural and Food Chemistr y 56: 8761-8773. 2008) . De hecho, existen patentes como la US 7.147.859 B2 (Bruno and Falci, 2006) en la que se describen diferentes formulaciones con p-sitosterol, uno de los fitosteroles más abundantes, entre sus componentes. Sin embargo, uno de los principales problemas para su incorporación en diferentes alimentos (principalmente derivados lácteos o de aceites vegetales) ha sido su alto punto de fusión y baja solubilidad. Una solución es esterificar los esteroles y estanoles libres con ácidos grasos de interés para aumentar su solubilidad (Thompson y Grundy. Histor y and development of plant sterol and stanol esters for cholesterol-Iowering purposes. The American Journal of Cardiology 96: 3-9. 2005; Villeneuve et al. Lipase-catalyzed synthesis of canola phytosterols oleate esters as cholesterol lowering agents. Enzyme and Microbial Technology 37: 150-155. 2005) . Ha sido demostrada mayor eficacia en reducir la absorción de colesterol a nivel intestinal con una dieta suplementada con fitosteroles esterificados que con fitosteroles libres (Weber et al. Cholesterol-Iowering food additives: lipase-catalysed preparation of phytosterol and phytostanol esters. Food Research International 35: 177-181. 2002) .

Uno de los primeros productos enriquecidos que comenzó a comercializarse en el año 1995 bajo la marca Benecol® es una margarina que incorpora un éster de estanol y cuyo lanzamiento al mercado fue consecuencia de la patente creada por la compañía finlandesa Raisio. Esta patente fue el punto de partida para el desarrollo de nuevos productos, así, en la patente US 6.087.353 (Stewart et al., 2000) se describe la posibilidad de hidrogenar los ésteres de fitosteroles con el fin de mejorar aún más su solubilidad y estabilidad para poder incorporarlos a diversos tipos de productos (bebidas, alimentos, nutracéuticos, etc) .

seguridad de esteroles y estanoles vegetales, con varios modelos animales e incluso celulares, a lo largo de los últimos años, ninguno ha revelado efecto adverso alguno para la salud. Por esta razón, se les considera como sustancia GRAS (Generally Regarded As Saje) tanto por los organismos regulatorios estadounidenses (FDA) como por los europeos (Thompson et o/., supra) .

La reacción de síntesis de estos compuestos es el punto clave para su obtención pudiendo ser ésta química o enzimática. Sin embargo, el gran gasto de energía que suponen los procesos de síntesis química, que suelen desarrollarse a altas temperaturas, junto con la formación de productos aterogénicos y cito tóxicos hace que se sigan buscando catalizadores alternativos y entre ellos los biocatalizadores enzimáticos pueden tener un importante papel (Villeneuve et o/., supra) .

Las lipasas (EC 3.1.1.3) , sobre todo aquéllas producidas por microorganismos, son sin duda las que se han empleado con mayor frecuencia con fines biotecnológicos en reacciones de síntesis.

Existen otras enzimas llamadas este rol esterasas (EC 3.1.1.13) que también son capaces de mediar reacciones de síntesis en las condiciones adecuadas. Entre las esterol esterasas más estudiadas se encuentra la de origen humano (Loomes y Senior. Bile salt activation of human cholesterol esterase does not require protein dimerisation. FEBS Letters 405: 369-372. 1997; Ikeda et o/. Cholesterol esterase accelerates intestinal cholesterol absorption. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -General Subjects 1571: 34-44. 2002; Brown et o/. Plant sterol and stanol substrate specificity of pancreatic cholesterol esterase. The Journal of Nutritional Biochemistr y 21: 736-740. 2010) . No existen muchas esterol esterasas microbianas descritas pero unas de las más conocidas son las isoformas LlP2 y LlP3 producidas por la levadura Candida rugosa (Benjamin y Pandey. Candida rugosa lipases: Molecular biology and versatility in biotechnology. Yeast 14: 1069-1087. 1998; Tenkanen et o/. Hydrolysis of ster y l esters by a lipase (Lip 3) from Candida rugosa. Applied Microbiology and Biotechnology 60: 120-127. 2002; Domínguez de María et o/. Understanding Candida rugosa lipases: An overview. Biotechnology Advances 24: 180-196. 2003; López et al. Reactivity of pure Candida rugosa lipase isoenzymes (Lip1, Lip2, and Lip3) in aqueous and organic media. Influence of the isoenzymatic profile on the lipase performance in organic recombinant Candida rugosa LI P3 lipase in Pichia pastoris and biochemical characterization of purified enzyme. J. Agric. Food Chem. 54: 5831-5838. 2006; Ferrer et al. Recombinant Candida rugosa LlP2 expression in Pichia pastoris under the control of the AOX1 promoter. Biochemical Engineering Journal 46: 271-277. 2009; Yen et al. Site-specific saturation mutagenesis on residues 132 and 450 of Candida rugosa LlP2 enhances catalytic efficiency and alters substrate specificity in various chain lengths of triglycerides and esters. Journal of Agricultural and Food Chemistr y 58: 10899-10905. 2010) . De hecho, existen crudos enzimáticos comercializados por Sigma (lipasa tipo VII de C. rugosa) Y Amano (Lipasa AY, Amano 30) con actividad LI P3 que se han empleado en varias ocasiones para la síntesis de diferentes compuestos (Bezbradica et al. The Candida rugosa lipase catalyzed synthesis of amyl isobutyrate in organic solvent and solvent-free system: a kinetic study. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 38: 11-16. 2006; Kim Y Akoh. Modeling and optimization of lipase-catalyzed synthesis of phytoster y l esters of oleic acid by response surface methodology. Food Chemistr y 102: 336-342. 2007) . También se han empleado otros crudos enzimáticos del hongo Aspergillus, poco caracterizados, para la síntesis de ésteres de fitosteroles (T6ke et al. Production and application of novel sterol esterases... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento de acilación de fitosteroles libres o de derivados saturados de éstos con ácidos grasos catalizado por una enzima este rol esterasa, caracterizado porque comprende una reacción de acilación en presencia de una este rol esterasa producida por hongos del género Ophiostoma.

2. Procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según la reivindicación 1, caracterizado porque la este rol esterasa es producida por hongos de la especie O. piceae.

3. Procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según la reivindicación 2, caracterizado porque la esterol esterasa es una enzima recombinante codificada por el gen de o. piceae.

4. Procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según la reivindicación 3, caracterizado porque la esterol esterasa recombinante se expresa en un organismo elegido entre E. coli, s. cerevisiae, P. pastoris, H. polymorpha, Y. lipolytica, A. nidulans y T. reesei.

5. Procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según la reivindicación 4, caracterizado porque la este rol esterasa recombinante tiene un extremo N-terminal modificado cuyas secuencias son SEQ ID No: 5 y SEQ ID No: 6.

6. Procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según una cualquiera de la reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los fitosteroles o fitostanoles empleados provienen de cualquier fuente vegetal, residuos lignocelulósicos o residuos de fabricación industrial de etanol, cerveza o papel.

7. Procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según la reivindicación 6, caracterizado porque los fitosteroles o los derivados saturados de éstos empleados provienen de la soja.

8. Procedimiento de acilación de fitosteroles según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque los fitosteroles vegetales utilizados se

brasicasterol y cualquier derivado o mezcla de éstos.

9. Procedimiento de acilación de fitosteroles según la reivindicación 8, caracterizado porque la mezcla de fitosteroles empleada comprende 55% de p-sitosterol, 10% de estigmasterol, 29% de campesterol y 6% de brasicasterol expresado en peso respecto al total de la mezcla.

10. Procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 caracterizado porque el ácido graso es un ácido graso saturado o insaturado, de entre 6 y 18 átomos de carbono.

11. Procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según la reivindicación 10, caracterizado porque el ácido graso es ácido laúrico.

12. Procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 ó 11, caracterizado porque la proporción molar de fitosterol:ácido graso o derivado saturado de fitosterol:ácido graso comprende valores entre 1:1 y 1:6.

13. Procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la esterol esterasa empleada como catalizador es un crudo enzimático producido como consecuencia del cultivo del hongo.

14. Procedimiento de acilación de fitosteroles o de derivados saturados de éstos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la esterol esterasa empleada como catalizador ha sido purificada mediante un método cromatográfico.

15. Procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, 13 ó 14, caracterizado porque se utiliza una dosis de enzima que comprende entre 1, 5 y 12 U/mL de reacción, preferentemente entre 3 y 6 U/mL.

16. Procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la reacción

de solvente orgánico yagua.

17. Procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según la reivindicación 16, caracterizado porque el sistema bifásico comprende un 10% de agua.

18. Procedimiento de acilación de fitosteroles o de derivados saturados de éstos según una cualquiera de las reivindicaciones 16 ó 17, caracterizado porque el solvente orgánico se elige entre el grupo que consiste en isooctano, n-hexano y tolueno.

19. Procedimiento de acilación de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque la reacción de acilación transcurre entre 24 y 35 oC, preferentemente a 28 oc.

20. Procedimiento de acilación de fitosteroles según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 , caracterizado porque:

a) los fitosteroles vegetales utilizados se eligen entre el grupo que consiste en psitosterol, estigmasterol, campesterol, brasicasterol y cualquier derivado o mezcla de estos;

b) el ácido graso es un ácido graso saturado o insaturado de entre 6 y 18 átomos de carbono; c) la esterol esterasa empleada como catalizador es un crudo enzimático producido como consecuencia del cultivo del hongo; d) la reacción transcurre en un sistema monofásico orgánico o bifásico que comprende una mezcla de solvente orgánico yagua; y e) la reacción de acilación transcurre entre 24 y 35 oc.

21. Procedimiento de acilación de fitosteroles según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque:

a) los fitosteroles empleados son una mezcla que comprende 55% de p-sitosterol, 10% de estigmasterol, 29% de campesterol, y 6% de brasicasterol, expresado en peso respeto al total de la mezcla;

b) el ácido graso es ácido láurico; c) la proporción de fitosterol:ácido graso comprende valores entre 1:1 y 1:6;

como consecuencia del cultivo del hongo;

e) se utiliza una dosis de enzima que comprende entre 1, 5 y 12 U/mL de reacción;

f) la reacción transcurre en un sistema monofásico orgánico, con isooctano, n-hexano o tolueno como solventes, o bifásico que comprende una mezcla de cualquiera de estos solventes orgánicos con un 10% de agua; y

g) la reacción de acilación transcurre a 28 oc.

22. Procedimiento de acilación de fitosteroles o de derivados saturados de éstos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque adicionalmente comprende una etapa de aislamiento en forma de polvo sólido del éster de fitosterol

o de un derivado saturado de éste.

23. Procedimiento de acilación de fitosteroles según una cualquiera de las reivindicaciones 20 ó 21, caracterizado porque adicionalmente comprende una etapa de aislamiento en forma de polvo sólido del éster de fitosterol.

24. Ésteres de fitosteroles obtenidos mediante un procedimiento tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

25. Ésteres de derivados saturados de fitosteroles obtenidos mediante un procedimiento tal como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, 10 a 19 ó 22 .

26. Producto enriquecido con ésteres de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos tal como se definen en la reivindicación 24 y 25, caracterizado porque dicho producto se elige entre el grupo que consiste en un alimento, un preparado alimenticio, un suplemento dietético y un medicamento.

27. Producto enriquecido con ésteres de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según la reivindicación 26, caracterizado por ser un producto alimenticio elegido entre el grupo que consiste en producto lácteo, producto derivado de la soja, cereal y mezcla de cereales.

28. Producto enriquecido con ésteres de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos según la reivindicación 26, caracterizado por ser un suplemento dietético o medicamento una forma sólida apta para administración oral.

29. Uso de los ésteres de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos tal como se definen en las reivindicaciones 24 y 25 respectivamente, o de un producto enriquecido con ésteres de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos tal como se define en las reivindicaciones 26 a 28 para la obtención de productos de interés alimenticio y/o farmacéutico.

30. Ésteres de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos tal como se definen en las reivindicaciones 24 y 25 respectivamente, o de un producto enriquecido con ésteres de fitosteroles o de los derivados saturados de éstos tal como se define en las reivindicaciones 26 a 28 para reducir los niveles de colesterol en plasma sanguíneo.