Una preparación de virus de la gripe recombinantes infecciosos preparada en ausencia de un virus auxiliar a partir de células puestas en contacto con una composición que comprende una pluralidad de vectores del ortomixovirus,

que comprende: (i) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de PA del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción, (ii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de PB1 del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción, (iii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de PB2 del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción, (iv) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de HA del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción, (v) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de NP del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción, (vi) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de NA del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción, (vii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de M del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción, (viii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de NS del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción, (ix) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido PA del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción, (x) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido PB1 del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción, (xi) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido PB2 del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción, y (xii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido NP del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción en donde dicha preparación se aísla a partir de dichas células

Virus de la gripe recombinantes para vacunas y terapia génica

Antecedentes de la invención

La capacidad para generar virus de ARN infecciosos a partir de ADNc clonado ha contribuido en gran medida al conocimiento biológico de estos patógenos y, por tanto, a mejorar los procedimientos de control de enfermedades (Palese y col., 1996) . Sin embargo, este progreso ha sido relativamente limitado para los virus de ARN con sentido negativo en comparación con los virus de ARN con sentido positivo, ya que ni el ARN viral (ARNv) genómico ni el ARN complementario antigenómico (ARNc) pueden servir como molde directo para la síntesis de proteínas. Más bien, el ARNv, tras su encapsulación por nucleoproteínas (NP) virales, debe transcribirse a ARNm con sentido positivo mediante el complejo de la ARN polimerasa viral. Por tanto, la unidad mínima de replicación está formada por el ARNv genómico formando complejo con las NP y las proteínas de la polimerasa. A pesar de estos obstáculos, se han establecido procedimientos de genética inversa para producir virus de ARN con sentido negativo no segmentados, incluyendo el virus de la rabia (Snell y col., 1994) , virus de la estomatitis vesicular (Lawson y col., 1995; Whelan y col., 1995) , virus del sarampión (Radecke y col., 1995) , virus respiratorio sincitial (Collins y col., 1995) , virus Sendai (Garcin y col., 1995; Kato y col., 1996) , virus de la peste bovina (Baron y col., 1997) , virus de la parainfluenza humana de tipo 3 (Hoffman y col., 1997) y SV5 (He y col., 1997) .

Las familias Orthomyxoviridae, Arenaviridae y Bunyaviridae contienen genomas de ARN con una cadena negativa segmentada e incluyen varios patógenos humanos y animales, por ejemplo, los virus de la gripe de tipos A, B y C (Orthomyxoviridae) , virus de la coriomeningitis linfocítica (LCMV) (Arenaviridae) y virus de la encefalitis y de la fiebre hemorrágica (Bunyaviridae, Arenaviridae) . Sus genomas están compuestos de dos (Arenaviridae) , tres (Bunyaviridae) o de seis a ocho (Orthomyxoviridae) moléculas de ARN de cadena sencilla de polaridad negativa (complementarias al ARNm) . Los ARNv interaccionan con NP y con la ARN polimerasa dependiente de ARN viral para formar complejos ribonucleoproteína (RNP) . Los RNP se rodean de una bicapa lipídica derivada de la célula hospedadora. En esta envuelta se insertan glucoproteínas virales, que esencialmente son para la unión al receptor y la entrada en la célula hospedadora. De este modo, la generación de virus de ARN con sentido negativo segmentado a partir de ADNc clonado supone un desafío formidable, ya que tiene que producirse un ARNv separado para cada segmento génico.

Bridgen y Elliott (1996) produjeron un virus Bunyamwera (familia Bunyaviridae) a partir de ADNc clonado que codificaba tres segmentos del ARNv con sentido positivo antigenómico. Sin embargo, la eficacia de recuperación del virus era baja. Ninguno de los ortomixovirus, que contienen seis (thogotovirus) , siete (virus de la gripe C) u ocho (virus de la gripe A y B) segmentos de ARN con sentido negativo se han producido por completo a partir de ADNc clonado. Esta demora en el progreso se ha dejado notar más intensamente en los esfuerzo para controlar las infecciones por el virus de la gripe.

Palese y colaboradores (Enami y col., 1990) han sido pioneros en sistemas de genética inversa dependientes de virus auxiliares para el virus de la gripe A (Figura 1A) . En sus aproximaciones, los complejos RNP se generan mediante la síntesis del ARNv in vitro en presencia de polimerasa purificada y de proteínas NP y, a continuación, se utilizan para transfectar células eucariotas. La infección posterior con el virus auxiliar de la gripe A da lugar a la generación de virus que poseen un gen derivado del ADNc clonado. Un segundo procedimiento, desarrollado por Neumann y col. (1994) , se basa en la síntesis in vivo de ARNv mediante la ARN polimerasa I (Figura 1B) , una enzima celular que transcribe el ARN ribosómico que carece tanto de la caperuza 5' como de la cola poli A 3'. Las células infectadas con el virus de la gripe y transfectadas con un plásmido que contiene el ADNc del virus de la gripe clonado, flanqueado por las secuencias promotora y terminadora de la ARN polimerasa I, producen el virus transfectantes. Sin embargo, con ambos procedimientos deben seleccionarse transfectantes a partir de un extenso fondo de virus auxiliares, lo que requiere un potente sistema de selección y complica la generación de virus con crecimiento defectuoso.

Mena y col. (1996) desarrollaron un sistema para generar partículas similares a virus (PSV) incompetentes para la replicación, en el que se transcribe in vitro un gen indicador que codifica un ARNv similar al virus de la gripe y se transfecta en células eucarióticas. Las diez proteínas del virus de la gripe se expresan a partir de plásmidos bajo el control de un promotor de la ARN polimerasa T7. Cuando las células transfectadas se infectan con un virus de la variolovacuna recombinante que expresa la ARN polimerasa T7, producen PSV de la gripe. Sin embargo, la eficacia del sistema es baja: en el 25% de los experimentos, los investigadores no consiguen una expresión detectable del gen indicador. Además, el virus de la variolovacuna expresa más de 80 proteínas, cualquiera de las cuales podría afectar al ciclo vital de la gripe.

Por tanto, es necesario un procedimiento para preparar virus con una cadena de ARN negativa segmentada, por ejemplo, ortomixovirus, tales como el virus de la gripe A, completamente a partir de ADNc clonadas.

Resumen de la invención

La invención da a conocer una preparación de virus de la gripe recombinantes infecciosos preparada en ausencia de un virus auxiliar a partir de células puestas en contacto con una composición que comprende una pluralidad de vectores del ortomixovirus, que comprende:

(i) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de PA del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(ii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de PB1 del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(iii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de PB2 del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(iv) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de HA del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(v) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de NP del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(vi) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de NA del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(vii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de M del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción, (viii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de NS del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(ix) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido PA del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(x) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido PB1 del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(xi) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido PB2 del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción, y

(xii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido NP del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción en donde dicha preparación se aísla a partir de dichas células. Otras realizaciones de esta preparación de virus de la gripe recombinantes infecciosos están caracterizadas en las reivindicaciones. La principal diferencia en comparación con las preparaciones de virus de la gripe obtenidas a partir de muestras nativas, según se describe en Suárez y col. (1992) , es que la preparación de virus de la gripe de la presente invención posee una homogeneidad excepcional.

La memoria descriptiva da a conocer al menos uno de los siguientes vectores aislados y purificados: un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un... [Seguir leyendo]

1. Una preparación de virus de la gripe recombinantes infecciosos preparada en ausencia de un virus auxiliar a partir de células puestas en contacto con una composición que comprende una pluralidad de vectores del ortomixovirus, que comprende:

(i) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de PA del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(ii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de PB1 del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(iii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de PB2 del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(iv) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de HA del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(v) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de NP del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(vi) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de NA del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(vii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de M del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción, (viii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un ADNc de NS del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(ix) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido PA del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(x) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido PB1 del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(xi) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido PB2 del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción, y

(xii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido NP del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción en donde dicha preparación se aísla a partir de dichas células.

2. La preparación de virus de la gripe recombinantes infecciosos según la reivindicación 1, en la que las células producen al menos 1x103 ufp/ml de virus de la gripe recombinantes.

3. La preparación de virus de la gripe recombinantes infecciosos según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que las células se ponen en contacto además con:

(xiii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido HA del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(xiv) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido NA del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(xv) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido M1 del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción,

(xvi) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido M2 del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción, y (xvii) un vector que comprende un promotor unido de forma operativa a un segmento de ADN que codifica un polipéptido NS2 del virus de la gripe y unido a una secuencia de terminación de la transcripción.

4. La preparación de virus de la gripe recombinantes infecciosos según la reivindicación 3, en la que las

células producen al menos 3x104 ufp/ml de virus de la gripe recombinantes.

5. La preparación de virus de la gripe recombinantes infecciosos según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el promotor es un promotor seleccionado del grupo que consiste en un promotor de la ARN polimerasa I, un promotor de la ARN polimerasa II, un promotor de la ARN polimerasa III, un promotor T7 y un promotor T3.

6. La preparación de virus de la gripe recombinantes infecciosos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que el promotor es un promotor de la ARN polimerasa I.

7. La preparación de virus de la gripe recombinantes infecciosos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que el promotor es un promotor de la ARN polimerasa I humana.

8. La preparación de virus de la gripe recombinantes infecciosos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que la secuencia de terminación de transcripción se selecciona del grupo que consiste en una secuencia de terminación de la transcripción seleccionada entre una secuencia de terminación de la transcripción de la ARN polimerasa I, una secuencia de terminación de la transcripción de la ARN polimerasa II, una secuencia de terminación de la transcripción de la ARN polimerasa III y una ribozima.

9. La preparación de virus de la gripe recombinantes infecciosos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que dos o más vectores están unidos físicamente.

10. La preparación de virus de la gripe recombinantes infecciosos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que uno o más vectores están en plásmidos separados.

11. La preparación de virus de la gripe recombinantes infecciosos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que el proceso además comprende la etapa de introducir al menos una mutación en uno o más del ADNc de PA de la gripe, el ADNc de PB1 de la gripe, el ADNc del PB2 de la gripe, el ADNc de HA de la gripe, el ADNc de NP de la gripe, el ADNc de NA de la gripe, el ADNc de M de la gripe o el ADNc de NS de la gripe, antes de introducir el vector en las células hospedadoras.

12. La preparación de virus de la gripe recombinantes infecciosos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que se introduce al menos una mutación en el ADNc de HA de la gripe antes de introducir los vectores dentro de las células hospedadoras.

13. La preparación de virus de la gripe recombinantes infecciosos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que uno o más vectores además comprenden secuencias no codificantes 3' y 5' de un virus de la gripe.

14. La preparación de virus de la gripe recombinantes infecciosos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que un vector codifica un péptido inmunogénico o una proteína útiles como vacuna.

15. La preparación de virus de la gripe recombinantes infecciosos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en la que las células hospedadores son células de mamífero.

16. La preparación de virus de la gripe recombinantes infecciosos según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, para su uso en terapia médica.

17. La preparación o el virus de la reivindicación 16, en donde dicha terapia médica consiste en su uso como una vacuna o en su uso en terapia génica.