VECTOR PARA LA COEXPRESIÓN DE VARIAS PROTEÍNAS HETERÓLOGAS EN CANTIDADES EQUIMOLARES.
Vector para la coexpresión de varias proteínas heterólogas en cantidades equimolares.
La invención se refiere a un vector de expresión basado en la secuencia nucleotídica del genoma de un Potyvirus, preferiblemente del virus del grabado del tabaco, que alberga una secuencia nucleotídica que codifica para al menos una proteína heteróloga, preferiblemente para dos y más preferiblemente para tres proteínas heterólogas. Las proteínas heterólogas se expresan, en la célula transfectada con este vector, como parte de la poliproteína viral y se encuentran flanqueadas por secuencias de reconocimiento de la proteasa viral NlaPro, la cual es capaz de liberarlas de la poliproteína completa durante el procesamiento postraduccional. Por tanto, el vector de la invención es útil para la coexpresión de una o de varias proteínas heterólogas en cantidades equimolares en la misma localización subcelular. La invención también se refiere a la célula, preferiblemente vegetal, que comprende este vector de expresión, al polen y a la planta que comprenden esta célula, al germoplasma de esta planta y a los métodos para la obtención de al menos una, dos o tres proteínas heterólogas.
Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201030342.
Solicitante: CONSEJO SUPERIOR DE INVESTIGACIONES CIENTIFICAS (CSIC).
Nacionalidad solicitante: España.
Inventor/es: DAROS ARNAU, JOSE ANTONIO, BEDOYA ROJAS,Leonor, MARTINEZ GARCIA,Fernando.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C12N15/83 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 15/00 Técnicas de mutación o de ingeniería genética; ADN o ARN relacionado con la ingeniería genética, vectores, p. ej. plásmidos, o su aislamiento, su preparación o su purificación; Utilización de huéspedes para ello (mutantes o microorganismos modificados por ingeniería genética C12N 1/00, C12N 5/00, C12N 7/00; nuevas plantas en sí A01H; reproducción de plantas por técnicas de cultivo de tejidos A01H 4/00; nuevas razas animales en sí A01K 67/00; utilización de preparaciones medicinales que contienen material genético que es introducido en células del cuerpo humano para tratar enfermedades genéticas, terapia génica A61K 48/00; péptidos en general C07K). › Vectores virales, p. ej. virus del mosaico de la coliflor.
PDF original: ES-2370673_A1.pdf
Fragmento de la descripción:
Vector para la coexpresión de varias proteínas heterólogas en cantidades equimolares.
La presente invención se encuadra en el campo de la ingeniería genética y específicamente se refiere a un vector de expresión basado en la secuencia nucleotídica del genoma de un Potyvirus, preferiblemente del virus del grabado del tabaco, cuyo cistrón de la RNA polimerasa viral Nlb se encuentra delecionado para albergar una secuencia nucleotídica que codifica para al menos una proteína heteróloga, preferiblemente para dos y más preferiblemente para tres proteínas heterólogas. Las proteínas heterólogas se expresan, en la célula transfectada con este vector, como parte de la poliproteína viral y se encuentran flanqueadas por secuencias de reconocimiento de la proteasa viral NlaPro, la cual es capaz de liberarlas de la poliproteína completa durante el procesamiento postraduccional. Por tanto, el vector de la invención es útil para la coexpresión de una o de varias proteínas heterólogas en cantidades equimolares en la misma localización subcelular.
Estado de la técnica anterior
Las plantas y sus virus forman una atractiva combinación desde el punto de vista de la biotecnología. El uso de las plantas como biofactorías despierta un gran interés debido a ventajas tales como el bajo coste de producción, la facilidad de escalado, la improbabilidad de que sus productos contengan patógenos humanos, el rico metabolismo que de por sí tienen las plantas o el hecho de poseer un sistema de modificación postraduccional de proteínas similar al de las células de mamíferos. A este potencial biotecnológico de las plantas hay que sumar la simplicidad genómica de los virus que las infectan.
En este sentido, los virus de plantas pueden ser una herramienta muy útil para programar la expresión de productos de interés en plantas huésped. Los virus de plantas como vectores de expresión aportan ventajas como son la rapidez en la producción o su capacidad intrínseca de manipular el control de la expresión génica del huésped para disparar la expresión de las proteínas "virales" a través, por ejemplo, de sus supresores de silenciamiento de RNA. Ejemplo de todo ello es que mediante sencillas manipulaciones de clones infecciosos de múltiples virus de plantas se han conseguido expresar productos génicos heterólogos (Shih, S. M., P. M. Doran, 2009, Biotechnology Advances, 27: 1036-1042).
Los potyvirus (género Potyvirus) son un grupo de virus de plantas que presentan una amplia diversidad, con más de cien especies de virus reconocidas, y muchas más propuestas, que infectan a un elevado número de especies vegetales de interés agronómico. Igualmente algunos potyvirus, como es el caso del virus del grabado del tabaco (TEV), infectan a más de cien especies en 19 familias de dicotiledóneas distintas, incluyendo plantas modelo y de interés agronómico (Fauquet, C. M., et al., 2005, Elsevier/Academic Press, London).
El genoma de los potyvirus está constituido por un RNA de polaridad (+) de 9,5 kb aproximadamente, unido en 5' a una proteína viral unida al genoma (VPg), con una cola poli(A) 3' y que se encapsida en viriones alargados y flexuosos (Riechmann, J. L., et al., 1992, Journal of General Virology, 73: 1-16). Este RNA codifica una poliproteína que es procesada de forma regulada por tres proteasas virales en diez productos génicos maduros aproximadamente, a los que probablemente hay que añadir el recientemente propuesto P3-PIPO. Las proteasas P1 y componente auxiliar (HC-Pro), en la región amino terminal de la poliproteína, catalizan su propio procesamiento, mientras que la proteasa NlaPro, o su versión no completamente procesada, Nla, en la que el dominio NlaPro está todavía unido al VPg, cataliza el resto de cortes proteolíticos en cis y en trans en la maduración de la proteína del TEV, reconociendo una diana de procesamiento conservada de siete aminoácidos (-6/+1) alrededor del punto de corte (Adams, M. J., et al., 2005, Molecular Plant Pathology, 6: 471-487). Esta proteasa también es activa en el procesamiento de una diana artificial introducida entre el marcador reportero de la β-glucuronidasa y la HC-Pro, una posición en la poliproteína donde esta proteasa no corta de manera natural (Carrington, J. C., et al., 1993, Journal of Virology, 67: 6995-7000).
El uso de diferentes sitios de inserción a lo largo del genoma de algunos potyvirus ha permitido la expresión de al menos una proteína heteróloga (US5491076A). También se ha llevado a cabo la coexpresión de dos y de hasta tres proteínas a partir de un único vector (Masuta, C., et al., 2000, Plant Journal, 23: 539-546; Beauchemin, C., et al., 2005, Virus Research, 112: 1-8). Así, un vector basado en el virus A de la patata que expresa tres proteínas heterólogas es infeccioso, estable y se mueve sistémicamente, encapsidándose en un virión coherentemente más largo, teniendo su genoma de RNA un 39,2% mayor que el del virus silvestre (Kelloniemi, J., et al., 2008, Virus Research, 135: 282-291). No obstante, las regiones de inserción en estos sistemas se localizan entre las secuencias codificantes de las proteínas virales, lo que supone una limitación en el tamaño de la secuencia heteróloga a insertar.
En cuanto a otros vectores diseñados para la expresión simultánea de varias proteínas en cantidades equimolares, existen casetes que comprenden la secuencia codificante para la proteasa viral Nla, múltiples sitios de resctricción de endonucleasas donde insertar las secuencias heterólogas de interés, y sitios de corte de esta proteasa que flanquean a la proteasa y a las secuencias de interés (WO9521249A1). Sin embargo, mediante estos vectores únicamente se ha conseguido expresar hasta dos proteínas heterólogas.
Por otro lado, es conocido que un mutante defectivo del TEV que contiene una deleción del cistrón completo de la RNA polimerasa viral Nlb puede ser complementado en trans y, consecuentemente, replicarse, infectar y moverse sistémicamente en plantas de tabaco transgénicas donde la proteína Nlb se suministra a través de la expresión de un transgén (Li, X. H., J. C. Carrington, 1995, PNAS, 92: 457-461). Esta complementación en trans también se produce en plantas de benthamiana silvestres que expresan la Nlb viral a partir de otro vector viral compatible como es el PVX (Lu, R., et al., 2003, EMBO J., 22: 5690-5699).
El uso de vectores virales para la expresión de productos genéticos heterólogos en plantas está lastrado, sin embargo, por, al menos, dos limitaciones. Una es la cantidad de información genética heteróloga que se puede llegar a expresar a partir de un único vector. La otra es el riesgo de utilizar vectores virales recombinantes con capacidad infecciosa y que, potencialmente, puedan escapar al medio ambiente. Por ello, es necesario el desarrollo de vectores de expresión que permitan coexpresar simultáneamente varias proteínas heterólogas en plantas en cantidades equimolares, los cuales dispongan de un mayor espacio para albergar secuencias exógenas sin que ello afecte a su estabilidad (aspecto de los sistemas de expresión heteróloga que depende en gran medida de la localización y del tamaño del inserto). Asimismo, sería deseable que dichos vectores de expresión permitieran tomar medidas eficaces de contención biológica.
Descripción de la invención
La presente invención proporciona un vector de expresión basado en la secuencia nucleotídica del genoma de un Potyvirus, preferiblemente del virus del grabado del tabaco, cuyo cistrón de la RNA polimerasa viral Nlb se encuentra delecionado para albergar una secuencia nucleotídica que codifica para al menos una proteína heteróloga, preferiblemente para dos y más preferiblemente para tres proteínas heterólogas. Las proteínas heterólogas se expresan, en la célula transfectada con este vector, como parte de la poliproteína viral y se encuentran flanqueadas por secuencias de reconocimiento de la proteasa viral NlaPro, la cual es capaz de liberarlas de la poliproteína completa durante el procesamiento postraduccional. Por tanto, el vector de la invención es útil para la coexpresión de una o de varias proteínas heterólogas en cantidades equimolares en la misma localización subcelular.
El vector de expresión diseñado en la invención está desarmado, por lo que puede expresarse de manera controlada en cualquier célula huésped susceptible a la infección por Potyvirus, ya que al tener delecionado... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Vector de expresión que comprende:
2. Vector de expresión según la reivindicación 1 donde el Potyvirus es el virus del grabado del tabaco.
3. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 donde la secuencia reguladora de la expresión génica de (b) es un promotor.
4. Vector de expresión según la reivindicación 3 donde el promotor es el 35S del virus del mosaico de la coliflor.
5. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde la secuencia reguladora de la expresión génica de (b) es un terminador.
6. Vector de expresión según la reivindicación 5 donde el terminador es el 35S del virus del mosaico de la coliflor.
7. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 donde la proteasa de (d) y/o (e) es NlaPro.
8. Vector de expresión según la reivindicación 7 donde la diana de reconocimiento de la proteasa NlaPro de (d) es SEQ ID NO: 1.
9. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8 donde la diana de reconocimiento de la proteasa NlaPro de (e) es SEQ ID NO: 2.
10. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde la proteína heteróloga codificada por la secuencia nucleotídica de (c) es una proteína repórter seleccionada de la lista que comprende: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5.
11. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde la secuencia nucleotídica de (c) codifica para al menos dos proteínas heterólogas separadas entre sí por una diana de reconocimiento de una proteasa.
12. Vector de expresión según la reivindicación 11 donde la proteasa es NlaPro.
13. Vector de expresión según la reivindicación 12 donde la diana de reconocimiento de la proteasa NlaPro que separa las dos proteínas heterólogas entre sí es SEQ ID NO: 2.
14. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 donde las dos proteínas heterólogas codificadas por la secuencia nucleotídica de (c) son dos proteínas repórter seleccionadas de la lista que comprende: SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 o SEQ ID NO: 5.
15. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 donde la secuencia nucleotídica de (c) codifica para al menos tres proteínas heterólogas separadas entre sí por una diana de reconocimiento de una proteasa.
16. Vector de expresión según la reivindicación 15 donde la proteasa es NlaPro.
17. Vector de expresión según la reivindicación 16 donde la diana de reconocimiento de la proteasa NlaPro que separa las tres proteínas heterólogas entre sí es SEQ ID NO: 2.
18. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 donde las tres proteínas heterólogas codificadas por la secuencia nucleotídica de (c) son las proteínas repórter SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 y SEQ ID NO: 5.
19. Célula que comprende de forma transitoria o de forma estable:
20. Célula según la reivindicación 19 que pertenece a una especie vegetal.
21. Polen que comprende la célula según la reivindicación 20.
22. Planta que comprende la célula según la reivindicación 20.
23. Planta según la reivindicación 22 que pertenece a la especie Nicotiana tabacum.
24. Germoplasma de la planta según cualquiera de las reivindicaciones 22 ó 23.
25. Uso del vector según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 para la expresión de al menos una proteína heteróloga.
26. Uso del vector según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 14 para la expresión de al menos dos proteínas heterólogas.
27. Uso del vector según cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18 para la expresión de al menos tres proteínas heterólogas.
28. Uso de la célula según cualquiera de las reivindicaciones 19 ó 20 o de la planta según cualquiera de las reivindicaciones 22 ó 23 para la producción de al menos una, dos o tres proteínas heterólogas.
29. Método para la obtención de al menos una proteína heteróloga que comprende:
30. Método para la obtención de al menos dos proteínas heterólogas que comprende:
31. Método para la obtención de al menos tres proteínas heterólogas que comprende:
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