SECUENCIA VIRAL IMPLICADA EN LA REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA. VECTOR DE EXPRESIÓN. CÉLULA Y PLANTA QUE LA COMPRENDE.

Secuencia viral implicada en la regulación de la expresión génica, vector de expresión, célula y planta que la comprende. La invención se refiere a una secuencia nucleotídica aislada, correspondiente a una secuencia de ARN del Virus del mosaico del pepino dulce, PepMV, implicada en la regulación de la expresión génica. En varias realizaciones preferidas, dicha secuencia comprende; una secuencia MCS reconocida por al menos una enzima de restricción única; una secuencia nucleotídica (P) que codifica para una proteína funcional o no funcional; una secuencia nucleotídica que codifica para una polimerasa de ARN dependiente de ARN (RpRd) y para una secuencia triple gene block (TGB) de un potexvirus (RpRd-TGB); o cualquier combinación de las anteriores. Además, la presente invención se refiere a un vector que comprende cualquier secuencia anterior, una célula o una planta que comprende cualquiera de dichas secuencias o vectores. Asimismo, la invención se refiere; al uso y método de cualquier secuencia o vector de la invención para la detección de al menos una planta del género Solanum resistente al virus PepMV; o al método para producción de una proteína funcional o no funcional, en la célula o la planta de la invención que comprende la cotransfección con una secuencia nucleotídica que codifica para una proteína de la cápsida (CP) de un potexvirus. Estado de la técnica anterior El Virus del mosaico del pepino dulce (Pepino mosaic virus, PepMV; Potexvirus) es un virus frecuente en cultivos de tomate en España, en el resto de Europa y también en América del Norte. Se trata de un virus compuesto por una sola cadena de ARN de sentido positivo con un tamaño de 6,4 kb (Aguilar et al., 2002. Arch Virol. 147: 2009-2015). Su genoma codifica 5 ORFs. El más próximo al extremo 5; supuestamente codifica la ARN polimerasa dependiente de ARN (RpRd) (163-164 kDa). Los siguientes ORFs, 2, 3 y 4, los cuales se solapan parcialmente en diferentes marcos de lectura, poseen la organización típica de potexvirus, de proteínas implicadas en el movimiento (triple gene block, TGB), y codifican péptidos de 26 kDa, 14 kDa y 9 kDa, respectivamente (Aguilar et al., 2002. Arch Virol, 147: 2009- 2015). El ORF más cercano al extremo 3; codifica la CP, con un tamaño de 25 kDa, responsable de la encapsidación del genoma viral e implicada en el movimiento célula a célula. La facultad que poseen los virus de ARN de una sola cadena para alterar el metabolismo celular y expresar proteínas codificadas por el genoma viral condujo a muchos investigadores a postular que los virus de ARN podían ser usados para producir proteínas recombinantes en las plantas infectadas (Pogue et al., 2002. Annu Rev Phytopathol. 40: 45-74). Existen diferentes estrategias para convertir el genoma de un virus en vector viral (Scholthof et al., 2002. Genetic engineering, 24: 67-85) pero este tipo de vectores, presenta a menudo una serie de limitaciones como son la inestabilidad (debido a fenómenos de recombinación homologa o no homologa) (Dawson et al., 1989. Virology, 172: 285-292), incapacidad del virus de colonizar homogéneamente todos los tejidos de la planta o problemas asociados a la bioseguridad. La posibilidad de manipular el genoma de un virus in vitro mediante clones infectivos permite explotar la capacidad de algunos virus para expresar proteínas foráneas, no codificadas de forma natural por el genoma viral (Scholthof y col., 1996. Annu Rev Phytopathol, 34: 299-323). Los clones infectivos de virus de plantas de ARN están compuestos básicamente por: 1) un ADN complementario (ADNc) al ARN genómico del virus, 2) una secuencia promotora de la transcripción fusionada a dicho ADNc y 3) y un vector de clonaje (plásmido bacteriano). En la actualidad existen varios ejemplos de virus utilizados como vectores virales (Lico et al., 2008. J Cell Physiol, 216: 366-377). No obstante, la selección de las secuencias reguladoras de la expresión de dichas proteínas foráneas óptimas, es un aspecto clave en la eficacia del sistema. Por tanto, se requiere un estudio pormenorizado de las secuencias de cada tipo viral para delimitar la secuencia que presente mayor eficacia. La selección de una secuencia mínima del virus PepMV que permita la expresión eficaz de proteínas foráneas en huéspedes naturales de dicho virus, supondría una potente herramienta que podría formar parte de un vector de expresión que permitiera producir proteínas in vivo con alto rendimiento. Explicación de la invención La invención se refiere a una secuencia nucleotídica aislada, correspondiente a una secuencia de ARN del Virus del mosaico del pepino dulce, PepMV, implicada en la regulación de la expresión génica. En varias realizaciones preferidas, dicha secuencia comprende; una secuencia MCS reconocida por al menos una enzima de restricción única; una secuencia nucleotídica (P) que codifica para una proteína funcional o no funcional; una secuencia nucleotídica que codifica para una polimerasa de ARN dependiente de ARN (RpRd) y para una secuencia triple gene block (TGB) de un potexvirus (RpRd-TGB); o cualquier combinación de las anteriores. Además, la presente invención se refiere a un vector que comprende cualquier secuencia anterior, una célula o una planta que comprende cualquiera de dichas secuencias o vectores. Asimismo, la invención se refiere; al uso y método de cualquier secuencia o vector de la invención para la detección de al menos una planta del género Solanum resistente al virus PepMV; o al método para producción de una proteína funcional o no funcional, en la célula o la planta de la invención que comprende la cotransfección con una secuencia nucleotídica que codifica para una proteína de la cápsida (CP) de un potexvirus. El virus PepMV reúne varias características que lo hacen un excelente candidato para utilizar sus secuencias como parte de un vector de expresión de proteínas de interés: 1.) Algunas de las proteínas que expresa su genoma, como la 2 ES 2 351 917 A1 CP, se acumulan a muy altos niveles en las plantas inoculadas; 2.) Los síntomas que induce en las plantas inoculadas son suaves y no conducen a la muerte de éstas; 3.) Está presente en los agroecosistemas de forma natural; 4.) Se acumula en grandes cantidades en N. benthamiana (planta candidata para la expresión de proteínas). En este trabajo se ha obtenido un vector de expresión autónomo capaz de expresar la GFP en plantas de N. benthamiana. Mediante la sustitución del gen GFP por otro de interés, se consigue la expresión del gen de interés en plantas. Tal como se describe en los ejemplos, en la presente invención se delimita una región del genoma del virus PepMV que actúa como promotora del ARN del ORF de la proteína CP. Los resultados obtenidos tras el ensayo de los mutantes permitieron: 1) delimitar el extremo 3 de esta región (a 36 nt aguas abajo del codón de inicio del ORF de la CP) y 2) mostrar su implicación en la capacidad de los mutantes para iniciar focos de infección. Para el desarrollo de un vector de expresión se delimitó también el extremo 5, el cual fue situado a 75 nt aguas arriba del codón de inicio del ORF de la CP. De la viabilidad de los vectores virales diseñados de PepMV se pudo deducir que la región seleccionada de 111 nucleótidos (SEO ID NO: 1-SEQ ID NO: 2) contenía todos los elementos funcionales necesarios para su actividad. Por tanto, se descartaron construcciones que no fueron infectivas con potenciales secuencias reguladoras de la expresión génica que tenían 88, 106 ó 124 nucleótidos (Fig. 19). Además, se demuestra que la sustitución de la secuencia reguladora de la expresión génica, SEQ ID NO: 1-SEQ ID NO: 2, por una secuencia heteróloga, también produce la expresión de la secuencia P. La secuencia heteróloga tal como se entiende en la presente invención hace referencia a una secuencia procedente de una cepa distinta de la cepa PepMV-Sp13. Por ejemplo, pero sin limitarse, la secuencia heteróloga procede de la cepa de Virus PepMV-Ch2. Preferiblemente, la secuencia heteróloga de la presente invención es una secuencia homologa. Las secuencias homologas se refieren a secuencias de cepas distintas con expresiones fenotípicas similares que proceden de una secuencia ancestral común. Los ensayos de agroinfiltración llevados a cabo con las secuencias de la invención, mostraron la capacidad de las mismas (así como del vector de expresión que las contiene) para expresar GFP (que sustituye la secuencia que codifica para la proteína CP) e infectar sistémicamente plantas de N benthamiana. La realización de ensayos de complementación en los que se aportó la proteína CP en trans (mediante co-transformación) demostró que era posible restaurar el movimiento célula a célula de mutantes que no expresan la CP, con lo cual se aumenta la capacidad de producción de proteínas por medio... [Seguir leyendo]

1. Secuencia nucleotídica aislada que tiene al menos un 80% de identidad con respecto a la secuencia SEQ ID NO: 1, implicada en la regulación de la expresión génica. 2. Secuencia nucleotídica según la reivindicación 1, donde dicha secuencia es SEQ ID NO: 1. 3. Secuencia según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, unida por su extremo 3 al extremo de la secuencia SEQ ID NO: 2. 4. Secuencia según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, unida por su extremo 3 a una secuencia nucleotídica (MCS), donde MCS es reconocida por al menos una enzima de restricción única. 5. Secuencia según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, unida por su. extremo 3 a una secuencia nucleotídica (P) que codifica para una proteína funcional o no funcional. 6. Secuencia según la reivindicación 5, donde la secuencia nucleotídica P codifica para una proteína funcional reporter. 7. Secuencia según la reivindicación 6, donde la proteína funcional reporter es GFP. 8. Secuencia según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, unida por su extremo 5 al extremo 3 de una secuencia nucleotídica que codifica para una polimerasa de ARN dependiente de ARN (RpRd) y para una secuencia triple gene block (TGB) de un potexvirus (RpRd-TGB). 9. Secuencia según la reivindicación 8, donde la secuencia nucleotídica que codifica para la secuencia RpRd-TGB pertenece al virus PepMV. 10. Vector de expresión que comprende la secuencia según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9. 11. Vector de expresión según la reivindicación 10, donde dicho vector es binario. 12. Vector de expresión según la reivindicación 11, donde dicho vector binario se expresa en una bacteria. 13. Vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, donde la secuencia según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 forma parte de un ADNt. 14. Célula que comprende de forma transitoria o de forma estable: a. la secuencia según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o b. el vector según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13. 15. Célula según la reivindicación 14, que pertenece a una especie vegetal. 16. Polen que comprende la célula vegetal según la reivindicación 15. 17.Planta que comprende la célula según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15. 18. Planta según la reivindicación 17 que pertenece al género Solanum. 19. Planta según la reivindicación 18 que pertenece a la especie Solanum lycopersicum. 20. Germoplasma de la planta según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19. 21. Uso de la secuencia según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la construcción de un vector de expresión. 22. Uso de la secuencia según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o del vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, para la detección de al menos una planta del género Solanum resistente al virus PepMV. 23. Uso de la secuencia o del vector según la reivindicación 22, donde la planta es de la especie Solanum lycopersicum. 24. Uso de la célula según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15, o de la planta según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, para la producción de una proteína funcional o no funcional. 24 ES 2 351 917 A1 25. Método para la producción de una proteína funcional o no funcional que comprende: a. Seleccionar la célula según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15, o la planta según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 19, y b. cotransfectar, de forma simultánea o no, dicha célula o de dicha planta, con una secuencia nucleotídica que codifica para una proteína de la cápsida (CP) de un potexvirus. 26. Método según la reivindicación 25, donde el potexvirus es el virus PepMV. 27. Método para la obtención del vector de expresión según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13 que comprende: a. Seleccionar la secuencia según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, b. insertar la secuencia del apartado (a) en un vector de expresión capaz de replicarse en al menos un tipo de célula huésped, y c. seleccionar el vector obtenido según el apartado (b) que comprende dicha secuencia. 28. Método para la obtención de la célula según cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15, que comprende: a. Obtener una célula de una muestra biológica, b. transfectar la célula huésped aislada del apartado (a) con un vector que comprende la secuencia según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, y c. seleccionar la célula transfectada según el apartado (b) que comprende dicha secuencia. 29. Método para la detección de al menos una planta del género Solanum, resistente al virus PepMV, que comprende: a. seleccionar al menos una planta de una colección de líneas mutantes del género Solanum, b. inocular al menos una planta del apartado (a) con la secuencia según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 9, o con el vector de expresión correspondiente según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 13, donde dicha secuencia o vector comprende la secuencia nucleotídica P y c. seleccionar al menos una planta resistente al virus PepMV que no exprese la proteína funcional o no funcional. 30. Método según la reivindicación 29, donde la planta del género Solanum pertenece a la especie Solanum lycopersicum. ES 2 351 917 A1 26 ES 2 351 917 A1 27 ES 2 351 917 A1 28 ES 2 351 917 A1 29 ES 2 351 917 A1 ES 2 351 917 A1 31 ES 2 351 917 A1 32 ES 2 351 917 A1 33 ES 2 351 917 A1 34 ES 2 351 917 A1 ES 2 351 917 A1 36 ES 2 351 917 A1 37 ES 2 351 917 A1 38 ES 2 351 917 A1 39 <110> Consejo Superior de investigaciones Científicas ES 2 351 917 A1 LISTA DE SECUENCIAS <120> Secuencia viral implicada en la regulación de la expresión génica, vector de expresión, célula y planta que la comprende <130> 1641.521 <160> 26 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 31 <212> DNA <213> Virus del mosaico del pepino PepMV - Sp13 <400> 1 <210> 2 <211> 80 <212> DNA <213> Virus del mosaico del pepino PepMV - Sp13 <400> 2 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador CE-42 <400> 3 <210> 4 <211> 39 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador CE-43 <400> 4 <210> 5 <211> 23 1 ES 2 351 917 A1 <212> DNA <213> Iniciador CE-198 virus del mosaico del pepino PepMV - Sp13 <400> 5 <210> 6 <211> 23 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador CE-199 <400> 6 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador CE-236 <400> 7 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Iniciador Pep303 virus del mosaico del pepino PepMV - sp13 <400> 8 <210> 9 <211> 36 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador CE-351 <400> 9 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> 2 <223> Iniciador CE-353 <400> 10 <210> 11 <211> 37 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador CE-456 <400> 11 <210> 12 <211> 37 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador CE-457 <400> 12 <210> 13 <211> 36 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador CE-458 <400> 13 <210> 14 <211> 36 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador CE-459 <400> 14 <210> 15 <211> 36 <212> DNA ES 2 351 917 A1 3 <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador CE-460 <400> 15 <210> 16 <211> 36 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador CE-461 <400> 16 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador CE-356 <400> 17 <210> 18 <211> 16 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Oligo dT <400> 18 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador CE-501 <400> 19 <210> 20 ES 2 351 917 A1 4 <211> 39 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador CE-502 <400> 20 <210> 21 <211> 38 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador CE-503 <400> 21 ES 2 351 917 A1 <210> 22 <211> 38 <212> DNA <213> Iniciador CE-504 Virus del mosaico del pepino PepMV - Sp13 <400> 22 <210> 23 <211> 33 <212> DNA <213> Iniciador CE-497 virus del mosaico del pepino PepMV - Ch2 <400> 23 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador CE-498 <400> 24 <210> 25 <211> 36 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador CE-499 <400> 25 <210> 26 <211> 33 <212> DNA <213> Secuencia artificial <220> <223> Iniciador CE-500 <400> 26 ES 2 351 917 A1 6 OFICINA ESPAÑOLA DE PATENTES Y MARCAS ESPAÑA