Un procedimiento in vitro de predicción de la susceptibilidad de un individuo a asma que comprende determinar si dicho individuo posee o no un haplotipo de variantes genéticas,

seleccionándose dichas variantes de variantes genéticas del gen humano de inositol polifosfato 4-fosfatasa (INPP4A) y la repetición del dinucleótido CA en el locus M1 localizado 44, 7 kb en la dirección 5' del sitio de iniciación de dicho gen, en el que dicho haplotipo está positivamente asociado o negativamente asociado a la aparición de asma.

Variantes genéticas de inositol polifosfato-4-fosfatasa humana tipo I (INPP4A) útiles para la predicción y la terapia de trastornos inmunológicos Campo de la invención La presente invención se refiere a variantes genéticas que incluyen variantes de corte y empalme del gen humano de inositol polifosfato 4-fosfatasa (INPP4A) útiles para la predicción de susceptibilidad al asma. Más particularmente, la invención proporciona cebadores y procedimientos adecuados para la detección de haplotipos de variantes alélicas del gen de INPP4A para la predicción de la susceptibilidad de un individuo al asma.

Antecedentes y referencias de la técnica anterior de la presente invención El asma es una enfermedad de las vías respiratorias crónica común con considerable heterogeneidad tanto en su fenotipo como en la patofisiología subyacente. Afecta al 15-18% de la población mundial. Se conocen casos tanto intrínsecos como extrínsecos de asma. El asma intrínseco es principalmente un trastorno de la infancia, aunque la edad de aparición puede variar y se observa que es 35-45 años en la población general; mientras que el asma extrínseco se observa cuando la edad de aparición es superior a los 45 años y es principalmente debido a los cambios inducidos por la edad en la función pulmonar. Estudios recientes han demostrado que la inflamación de las vías respiratorias es una característica principal en la patofisiología del asma (Gem y col. 1999) . El trastorno es multifactorial (en tanto la iniciación como la progresión) debido a la participación de numerosas células inflamatorias residentes y reclutadas. Se sabe que las respuestas mediadas por linfocitos T e IgE son un factor clave en la respuesta alérgica (Elias y col. 2003) . El asma es un trastorno mediado por linfocitos T colaboradores de tipo 2 (Th2) con citocinas tales como interleucina 4, interleucina 5, interleucina 13 implicadas en la desviación del sistema inmunitario hacia atopicidad. El aumento de los niveles de estas citocinas conduce a elevados niveles de IgE en suero totales, reclutamiento de eosinófilos e hiperreceptividad bronquial que por último culminan en la patogénesis del asma. También se sabe que estas interleucinas interactúan y estimulan las células alveolares y las células bronquiales del músculo liso produciendo los fenotipos clínicos de hiperreceptividad bronquial (Barnes P. J., Respir. Res, 2:64-5, 1999) . Las interacciones gen-gen y gen-entorno participan en el desarrollo del asma (Tay y col., Asian Pac J Allergy Immunol 17:239-42, 1999; Bleecker ER, Am J Respir Crit Care Med 156:S113-6, 1997; Cookson W, Nature 402:B5-11, 1999) .

La inflamación y la remodelación de las vías respiratorias son rasgos característicos del asma atópico. Diversos tipos de células, a saber: eosinófilos, mastocitos y linfocitos T migran a los pulmones y median en el proceso de inflamación en el sitio (Barnes PJ, 1992) . Además de estas células, las plaquetas desempeñan una función clave en este proceso inflamatorio alérgico debido a que son una rica fuente de una amplia gama de materiales biológicamente activos que pueden inducir o aumentar las respuestas inflamatorias alérgicas (Herd CM, 1994, Klinger, 1995) . Se ha demostrado que tales materiales son mediadores preformados guardados en a-gránulos que son quimiocinas tales como el factor plaquetario 4 (PF4) y se regulan tras la activación en linfocitos T normales expresados y supuestamente secretados (RANTES) (Herd CM, 1994, Klinger, 1995) . Estas quimiocinas son liberadas de plaquetas después de la estimulación con potentes mediadores anafilácticos tales como factor activador de plaquetas (PAF) (Herd CM, 1994, Kameyoshi Y, 1992) y producen quimiotaxia eosinofílica (Kameyoshi Y, 1992) , proporcionando pruebas adicionales de una contribución de las plaquetas al asma bronquial. Estudios en modelo de ratón de inflamación alérgica sugieren la función de las plaquetas en la remodelación de las vías respiratorias (Simon C y col., 1994) . Se ha encontrado que la activación de plaquetas está asociada a la inactivación de una enzima independiente de magnesio, la inositol polifosfato 4-fosfatasa (INPP4A, EC 3.1.3.66) (Norris FA, 1997) . La estimulación de plaquetas humanas con trombina o ionóforo de calcio produce la inactivación de la INPP4A por escisión proteolítica por la proteasa calpaína dependiente del calcio (Norris FA y col., 1997) . La enzima INPP4A cataliza la hidrólisis del fosfato en la posición 4 del inositol 3, 4-bisfosfato y del inositol 1, 3, 4-trisfosfato. También cataliza, a una velocidad mucho mayor, la hidrólisis del fosfato en la posición 4 del fosfatidilinositol 3, 4-bisfosfato generado por la fosforilación en la posición D-3 de lípidos de inositol por fosfoinositida 3-cinasas (PI3K) . Por tanto, la inactivación de INPP4A está asociada a calcio/acumulación dependiente de la agregación de PtdIns (3.4) P2 característica de plaquetas humanas estimuladas. Norris y col. (1995) observaron que la INPP4A también participa en mitogénesis mediada por el receptor de PDGF, rotura oxidativa de neutrófilos, translocalización del transportador de la glucosa a la membrana plasmática. Vyas P y col. 2000 encontraron que la INPP4A regula la proliferación celular en la dirección 3' del factor de transcripción GATA-1. Se encontró que los megacariocitos de GATA-1 (precursor de plaquetas) carecían de esta enzima y mostraron hiperproliferación. La reintroducción de INPP4A en los megacariocitos de GATA-1-retrasó significativamente el crecimiento celular, sugiriendo la función de esta enzima en la proliferación celular. Cuando se comparó la expresión génica diferencial entre pulmones de ratones A/J sensibilizados/expuestos a albúmina de huevo frente a ratones de control se encontraron diversos genes que se expresaban de forma diferente (Base de datos Gene Expression Omnibus (GEO) , GDS 349) . Entre estos genes que se expresan de forma diferente también se encontró que la INPP4A se modulaba en los pulmones de ratones sensibilizados.

El gen de INPP4A codifica dos isoformas a y º de proteínas variables en su extremo carboxi y también se conocen diversas variantes de corte y empalme en la región del exón 17, 18 y 19 de este gen (NT022171) , anteriormente designado exón 15, 16 y 17 (Shearn CT y col., 2001) . Se han anotado dos exones más que codifican 5' UTR en el cóntigo NT022171. Hay 3 formas de corte y empalme, a saber;a1, 2 y 3 informadas en la región del exón 17-19 como se muestra en la Figura 1A.

INPP4 a 1 codifica una forma de 106 kDa de la enzima principal expresada en cerebro humano, de rata y de ratón (Norris FA y col., 1995; Vyas P y col., 2000) . INPP4 a2codifica una forma de102 kDa que se expresa en especies menores en cerebro de rata y ratón (Norris FA y col., 1995) . La isoforma a 3 resulta del uso de un sitio donante de corte y empalme de 5'-GU alternativo durante la escisión del intrón 17 y extiende el exón 17 120 pb y codifica una proteína de 110 kDa expresada como la forma principal en plaquetas humanas (Shearn CT y col., 2001) . Esta región del exón 17 extendido contiene tres repeticiones separadas siete bases con la secuencia de nucleótidos CCCCTYCW en la que Y representa C o T y W representa A o T. El exón 18 también contiene una secuencia con este consenso. Estos elementos ricos en pirimidina consenso representan sitios de reconocimiento para factores de corte y empalme que regulan el corte y el empalme alternativo específico de tejido de los exones 17 y 18. El exón 17 extendido codifica un dominio de 40 aminoácidos que contiene la secuencia PEST. Las secuencias PEST son ricas en residuos de prolina, serina, glutamato/aspartato y treonina y las proteínas que contienen tales secuencias son rápidamente degradadas por la familia calpaína de proteasas (Rogers S y col., 1986; Rechsteiner M y Rogers S 1996) .

La enzima INPP4A que contiene secuencias PEST también es rápidamente degradada por la familia calpaína de proteasas que actúa sobre proteínas que contienen secuencias PEST (Norris FA y col., 1997) . Como la estimulación de plaquetas está asociada al asma, que a su vez guarda relación con la inactivación de la enzima INPP4A, los inventores plantearon como hipótesis que las variantes de genes de INPP4A podrían asociarse a trastornos inmunológicos que incluyen asma. Sin embargo, hasta la fecha no se han hecho estudios para estudiar la función genética de INPP4A en trastornos inmunológicos que incluyen asma atópico.

Novedad de la invención:

Los inventores han identificado por primera vez variantes del gen de INPP4A asociadas a asma en seres humanos que incluyen los polimorfismos de un único nucleótido +92031 A/T (S1) , +92344 C/T (S2) , +92817... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento in vitro de predicción de la susceptibilidad de un individuo a asma que comprende determinar si dicho individuo posee o no un haplotipo de variantes genéticas, seleccionándose dichas variantes de variantes genéticas del gen humano de inositol polifosfato 4-fosfatasa (INPP4A) y la repetición del dinucleótido CA en el locus M1 localizado 44, 7 kb en la dirección 5' del sitio de iniciación de dicho gen, en el que dicho haplotipo está positivamente asociado o negativamente asociado a la aparición de asma.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que se determina un haplotipo que representa una combinación de variantes seleccionadas de una variante alélica de dicha repetición del dinucleótido CA en el locus M1, variante +92031A/T en el locus S1, repetición del dinucleótido CA en el locus M3 en +99095 y variante +110832 A/G en el locus S4.

3. Un procedimiento según la reivindicación 2, en el que se determina un haplotipo de cuatro loci con referencia al orden de los loci M1_S1_M3_S4 y se selecciona de:

396_T_154_G, 398_A_152_A, 400_T_152_A, 400_A_152_A, 406_T_152_A, 406_A_156_T, 412_A_154_A, 400_T_154_A, 402_T_152_A, 404_A_156_T, 410_A_154_A, 404_A_152_G, 406_A_152_A, 404_A_152_A, 406_T_152_G, 396_A_152_G, 400_A_154_G, 402_T_154_A, 402_A_152_A, 404_T_154_A, 400_T_154_G, 396_T_152_G, 404_T_152_A, 398_A_152_G, 386_A_154_A, 402_T_152_G, 398_T_152_G, 404_A_154_G, 408_A_154_A, 406_A_154_A, 398_A_154_A, 404_T_152_G, 400_A_154_A, 400_T_152_G, 402_A_154_A, 404_A_154_A

en el que el primer número representa la longitud en pares de bases del fragmento obtenible por la amplificación por PCR correspondiente al locus M1 usando el par de cebadores de SEC ID Nº 7 y 8 y el último número representa la 15 longitud en pares de bases obtenible por la amplificación por PCR correspondiente al locus M3 usando el par de cebadores de SEC ID Nº 11 y 12.

4. Un procedimiento según la reivindicación 3, en el que el haplotipo 402_A_154_A se detecta como un factor de riesgo para asma.

5. Un procedimiento según la reivindicación 3, en el que el haplotipo 400_A_154_A y/o 400_T_152_G se detecta

como negativamente asociado a la aparición de asma y/o el haplotipo 400_T_152_G se detecta como negativamente asociado a la aparición de asma atópico.

6. Cebadores definidos por SEC ID Nº 7-18 para su uso en la predicción de la predisposición a asma.

7. Cebadores según la reivindicación 6 adicionalmente complementados con los cebadores definidos por SEC ID Nº 19-23.

8. Uso in vitro de cebadores definidos por SEC ID Nº 7-18 para predecir la predisposición a asma.

9. El uso según la reivindicación 8, en el que dichos cebadores están adicionalmente complementados por los cebadores definidos por SEC ID Nº 19-23.

10. Un procedimiento in vitro para detectar y predecir la predisposición a asma cribando haplotipos de INPP4A y variantes de corte y empalme y su expresión en un sujeto, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:

[a] aislar ADN de muestras seleccionadas de sangre completa, semen, saliva, lágrimas, orina, materia fecal, sudor, de la boca, piel o pelo;

[b] proporcionar cebadores que tienen SEC ID Nº 7-18;

[c] amplificar y secuenciar extensiones de ADN genómico usando cebadores de SEC ID NÂ.

7. 18, en el que los cebadores de SEC ID Nº 7, 9, 11, 13, 15, 17 son cebadores directos y los cebadores de SEC ID Nº 8, 35 10, 12, 14, 16, 18 son cebadores inversos;

[d] amplificar y secuenciar la extensión de ADN de SEC ID Nº 1 del gen de INPP4A usando la combinación de cebadores de SEC ID Nº 7 y 8, conteniendo SEC ID Nº 1 la secuencia correspondiente a la repetición de microsatélites en el locus M1 D2S2311;

[e] amplificar y secuenciar la extensión de ADN de SEC ID Nº 2 del gen de INPP4A usando la combinación 40 de cebadores de SEC ID Nº 9 y 10, conteniendo SEC ID Nº 2 la secuencia correspondiente a la repetición de microsatélites en el locus M2 D2S2187 en la posición +43987 en el intrón 1;

[f] amplificar y secuenciar la extensión de ADN de SEC ID Nº 3 del gen de INPP4A usando la combinación de cebadores de SEC ID Nº 11 y 12, conteniendo SEC ID Nº 3 la secuencia correspondiente a la repetición de microsatélites en el locus M3 +99095;

[g] amplificar y secuenciar la extensión de ADN de SEC ID Nº 4 del gen de INPP4A usando la combinación de cebadores de SEC ID Nº 13 y 14, conteniendo SEC ID Nº 4 el locus S1 +92031A/T, el locus S2 +92344 C/T y el locus S3 locus +92817C/T de sitios de polimorfismo de un único nucleótido (SNP) ;

[h] amplificar y secuenciar la extensión de ADN de SEC ID Nº 5 del gen de INPP4A usando la combinación de cebadores de SEC ID Nº 15 y 16, conteniendo SEC ID Nº 5 el sitio de SNP en el locus S4 en la posición +110832A/G en el exón 17 de variante de variante de corte y empalme;

[i] amplificar y secuenciar la extensión de ADN de SEC ID Nº 6 del gen de INPP4A usando la combinación de cebadores de SEC ID Nº 17 y 18, conteniendo SEC ID Nº 6 el sitio de SNP en el locus S5 en la posición +131237 C/T, y [j] validar e identificar las variantes del gen de INPP4A específicas computacionalmente comparando con las secuencias del gen de INPP4A naturales conocidas; y [k] aislar ARN de muestras de sangre completa; y [l] aislar e identificar variantes de corte y empalme de SEC ID Nº 24 usando la combinación de cebadores de SEC ID Nº 25 y26.

11. Un procedimiento según la reivindicación 10, en el que el sujeto es humano.

12. Marcadores farmacogenéticos que tienen SEC ID Nº 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 24 para su uso en detectar y predecir la predisposición a asma en un sujeto, teniendo dichos marcadores las siguientes características:

(i) la SEC ID Nº 1 contiene 1-230 nucleótidos contiguos que contienen un grupo de dinucleótidos CA del locus M1 presente 44, 7 kb en la dirección 5' del sitio de iniciación del gen;

(ii) la SEC ID Nº 2 contiene 1-400 nucleótidos contiguos que contienen los dinucleótidos GT en el locus M2;

(iii) la SEC ID Nº 3 tiene 1-159 nucleótidos contiguos que contienen un polimorfismo de repetición de CA en el nucleótido 229 del locus M3;

(iv) la SEC ID Nº 4 tiene 1-1036 nucleótidos contiguos que contienen un polimorfismo A/T en el nucleótido 75 del locus S1, un polimorfismo C/T en el nucleótido 388 del locus S2 y un polimorfismo C/T en el nucleótido 861 del locus S3;

(v) la SEC ID Nº 5 tiene 1-961 nucleótidos contiguos que contienen un polimorfismo G/A en el nucleótido 147 del locus S4;

(vi) la SEC ID Nº 6 tiene 1-1707 nucleótidos contiguos que contienen un polimorfismo C/T en el nucleótido 1221 del locus S5;

(vii) la SEC ID Nº 24 tiene 1-817 nucleótidos contiguos que contienen variantes de corte y empalme.

13. Un kit de diagnóstico que comprende marcadores farmacogenéticos que tienen los nucleótidos de SEC ID Nº 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 24 junto con un manual de instrucciones para detectar y predecir la predisposición a asma en un sujeto.

14. Uso in vitro de un kit de diagnóstico según la reivindicación 13 para predecir y detectar seres humanos susceptibles a asma.

FIGURA 1A.

Fig. 1. Diagrama esquemático del gen de INPP4A con las variantes conocidas (A) y los loci estudiados (B) .

Fig. 2 Visión general gráfica del desequilibrio de enlace para los ocho loci estudiados usando GOLD (la distancia entre marcadores entre M1 y M2 se ha reducido 50 kb en el mapa para una clara visión general gráfica) .

Fig. 3: Distribución alélica de los alelos de D2S311 en pacientes y el grupo de control (Np = 192, Nc = 272)

Fig. 4: Distribución alélica y genotípica de +92031 A/T (S1) en el estudio de casos y controles Fig. 5: Distribución alélica y genotípica del polimorfismo de repeticiones de CA/CT en el intrón 11 en el estudio de casos y controles.

Fig. 6: Distribución de haplotipos en pacientes y controles (Np = 192, Nc = 272)

ARNm de 3

(Puntuación de PESTfind: +7, 49)

(Puntuación de PESTfind: +4, 95)

Figura 7: A. Las puntuaciones comparativas de la posible secuencia PEST (www.at.cmbnt.org/embnet/tools/bio/pestfind/) antes y después de la sustitución de treonina por alanina en el aminoácido 604. B) Análisis de transferencia Western para INPP4A y 1-tubulina en plaquetas aisladas de sangre humana (una imagen representativa de tres experimentos independientes) que tienen genotipos AG (carriles 1, 2 y 3) , GG (carriles 4, 5 y 6) y AA (carriles 7, 8 y 9) . Los carriles 1, 4 y 7 representan plaquetas sin estimulación, los carriles 2, 5 y 8 representan plaquetas estimuladas con ionomicina 2 !M durante 5 minutos, los carriles 3, 6 y 9 estimuladas con ionomicina 2 !M durante 10 minutos. C) Intensidad relativa de proteína de INPP4A con respecto a 1-tubulina en plaquetas sin estimular y estimuladas por barrido por densitometría de puntos de datos de transferencia Western.

Figura 8: Imagen de gel de variantes de corte y empalme en individuo asmático atópico que muestra la variante de corte y empalme novedosa de 598 pb. Carril M: marcador en escalera de 100 pb, carril N: normal, carril P: asmático atópico.

Figura 9: Inmunohistoquímica de INPP4A en secciones de tejido de pulmón de ratón (20x) de (a) ratones sensibilizados con referencia y expuestos a solución salina, (b) ratones sensibilizados con OVA y expuestos a OVA y (c) ratones sensibilizados con OVA y expuestos a OVA tratados con dexametasona a partir del día uno de la exposición. Las flechas negras indican células inflamatorias infiltrantes en la región broncovascular (bronquio B) .

* Imagen representativa del experimento hecho en ratones BALB/c hembra. La sensibilización con OVA y el experimento de tratamiento con solución salina se hizo en 3 experimentos independientes que tenían al menos 3 ratones en cada grupo (dos veces con ratones BALB/c macho y una vez con ratones BALB/c hembra) . El experimento de tratamiento con esteroide se hizo una vez con ratones BALB/c hembra.