Vacuna de células híbridas contra la leishmaniasis [KALA-AZAR].

Una vacuna de células híbridas contra la Leishmaniasis que comprende un macrófago (o macrófagos) singénico con un antígeno de Leishmania Proteína-11 de la Membrana de Kinetoplástidos inmunodominante electrofusionado con una célula (o células) dendrítica alogénica.

Vacuna de células híbridas contra la Leishmaniasis [KALA-AZAR]

La presente invención se refiere a una vacuna de células híbridas contra la Leishmaniasis que comprende un macrófago singeneico con un antígeno-KMP-11 de Leishmania electrofusionado con células dendríticas alogénicas, particularmente para su uso contra leishmaniasis visceral. La vacuna de la presente invención fue capaz de conseguir la eliminación completa de la carga de parásitos esplénica y hepática en fase tardía de infección por L. donovani en ratones BALB/c genéticamente susceptibles.

La Leishmaniasis Visceral (LV) , conocida también como Kala-azar, está provocada por miembros del complejo de L. donovani dando como resultado síntomas clínicos de fiebre amarilla, caquexia, hepatoesplenomegalia y citopenia sanguínea. La LV activa está asociada con la ausencia de respuesta inmune mediada por células específicas de parásitos (9, 10) . La LV también se ha reconocido cada vez mas como una infección oportunista en individuos infectados por el virus VIH (11) . La OMS ha identificado la Leishmaniasis como un problema de salud pública principal y en aumento (12) . Si no se trata, la forma visceral de la Leishmaniasis es letal con epidemias recientes en Sudán y en Indica que han producido más de 100.000 muertes (13) .

Las formas actuales del régimen quimioterapéutico contra Kala-azar en todo el mundo tienen graves limitaciones debido al efecto tóxico, a la duración del tratamiento prolongada, y en algunos casos, a un elevado coste prohibitivo de tratamiento. El fracaso de los antiamoniacales pentavalentes -la actual forma principal de tratamiento quimioterapéutico en todo el mundo, se atribuye a la aparición de resistencia al antimonio de las cepas de Leishmania dando como resultado frecuentes reincidencias después del tratamiento (14, 15) . En la India, el antimonio ya no es útil como un fármaco ya que el 65% de los pacientes con LV no responden o reinciden inmediatamente (16) . Los tratamientos quimioterapéuticos alternativos con anfotericina B y su formulación lipídica tienen graves limitaciones debido al efecto tóxico y elevado coste prohibitivo de tratamiento (15) .

Limitaciones en aumento en cuanto a las estrategias quimioterapéuticas disponibles debido a la aparición de cepas resistentes y a la ausencia de una estrategia de vacuna terapéutica eficaz contra la LV intensifican la crisis. Por lo tanto, se han realizados intentos para usar un enfoque terapéutico de células híbridas contra la Leishmaniasis visceral. Las vacunas basadas en células dendríticas [CD] modificadas por ingeniería genética representan una herramienta poderosa para la inmunoterapia, aunque hasta ahora solo se ha implementado en el modelo contra el cáncer. La presente invención sostiene, por primera vez, que la terapia de células híbridas basada en CD puede implementarse en diseños de futuras vacunas contra el estado avanzado de la Leishmaniasis Visceral [LV] y tiene el potencial de usarse en enfermedades parasitarias intracelulares en general.

Una evaluación realista de la eficacia de una vacuna contra la Leishmaniasis depende de 3 importantes variables que los autores de la presente invención han considerado - (i) constitución genética del hospedador; (ii) naturaleza del antígeno sometido a ensayo; (iii) naturaleza de la vacuna. Considerando la primera variable, el objetivo de la presente invención fue formular una estrategia de vacuna que se basó en su implementación en un modelo de hámster dorado ya que las características clinicopatológicas reflejan ampliamente la LV progresiva humana, mostrando un incesante aumento en la carga visceral, caquexia progresiva, hepatoesplenomegalia, pancitopenia, hipergammaglobulinemia y finalmente la muerte (1) .

45 Basándose en la selección de la Proteína 11 de la Membrana de Kinetoplástidos [KMP-11] se trató la segunda variable como un antígeno candidato de vacuna. La Proteína 11 de la Membrana de Kinetoplástidos [KMP-11], una proteína de membrana de superficie muy conservada presente en todos los miembros de la familia Kinetoplastidae, se expresa diferencialmente en formas amastigotas y promastigotas de Leishmania (2 -4) . En un informe previo, se había realizado la implicación hacia una asociación de la expresión de la KMP-11 con la posible vacuna de una cepa de Leishmania UR6 avirulenta, atenuada (5) . Adiemás, se había descrito la capacidad de la KMP-11 para inducir IFN-γ a partir de PBMC derivada de pacientes curados de LV de Kenia (6) . En las formas de Leishmaniasis cutánea y visceral se indican diversos hallazgos hacia una respuesta del hospedador dispar contra diferentes antígenos parasitarios. La glucoproteína 63 (gp63) de la Leishmania no induce IFN-γ significativa a partir de linfocitos de pacientes curados de LV (6) . Por otro lado, el mismo antígeno, gp63, induce altos niveles de IFN-γ a partir de 55 linfocitos de pacientes curados de LC (8) . A diferencia de gp63, KMP-11 induce producción significativa de IFN-γ a partir de linfocitos de pacientes curados de LV (6) . Por tanto, la naturaleza del antígeno que ejerce influencia sobre la respuesta inmune del hospedador contra diferentes especies de Leishmania se encuentra en observación.

Teniendo en cuenta los hechos hasta ahora conocidos en cuanto a que el plásmido transfectado que codifica al antígeno inmunodominante se expresa a través de la ruta de la clase I y que las CD son los miembros más importantes de la clase general de CPA (células presentadoras de antígenos) , los inventores de la presente invención se percataron de que la transfección del plásmido que codifica el antígeno KMP-11 podría ayudar a centrar la respuesta inmune para generar antígenos específicos de LCT (linfocitos citolíticos) contra este antígeno inmunodominante definido. Adicionalmente, se espera reforzar la antigenicidad de las CPA transfectadas por la 65 contribución de la clase II del MHC alogénico para dar lugar a una respuesta Th más potente y un mecanismo efector en términos de generación de LCT mediado por un epítopo presentador de celulas común para las moléculas de clase I del MHC singénicas y de clase II alogénicas. Por lo tanto, en la presente invención se proporciona una terapia de células híbridas basadas en CD modificadas por ingeniería genética en un modelo de LV experimental, obtenido por transfección de CD con el antígeno KMP-11 dominante.

El documento EP 1130088 se refiere a métodos para el tratamiento y prevención del cáncer y enfermedades infecciosas usando células hibridas formadas por fusión de células dendríticas alogénicas y células no dendríticas autólogas. Se dice que tales células híbridas combinan la enérgica aloreactividad de las CD maduras con la antigenicidad específica de células tumorales autólogas, suscitando así una alta especifidad y respuesta enérgica de LCT. Se dice que los métodos desvelados en el presente documento pueden tratar o prevenir infecciones causadas por protozoos patógenos tales como, pero sin limitación, Entomoeba histolytica, Trichomonas tenas, Trichomonas hominis, Trichomonas vaginalis, Tr y panosoma gambiense, Tr y panosoma rhodesiense, Tr y panosoma cruzi, Leishmania donovani, Leishmania tropica, Leishmania braziiiensis, Pneumocystis pneumonia, Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum y Plasmodium malaria.

Por tanto, el principal objeto de la presente invención es proporcionar una vacuna de células híbridas contra la Leishmaniasis que comprende un macrófago singeneico con un antígeno-KMP-11 de Leishmania dominante electrofusionado con células dendríticas alogénicas.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una vacuna de células híbridas en la que el antígeno KMP-11 de Leishmania se obtiene de Leishmania donovani. Otro aspecto de la presente invención es proporcionar una vacuna en la que la vacuna estimula respuestas de anticuerpos, respuestas de LCT, respuestas proliferativas de células T, generación de IL-2, reducción de carga parasitaria en bazo e hígado junto con una cura estéril contra la Leishmania tras la vacunación terapéutica a un mamífero.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar una vacuna en la que dicha vacuna puede proteger al bazo y al hígado de parásitos hasta seis veces la dosis eficaz de dicha vacuna.

Otro aspecto más de la presente invención es proporcionar una formulación de vacuna híbrida contra la Leishmaniasis que comprende un macrófago singeneico con un antígeno-KMP-11 de Leishmania dominante electrofusionado con células dendríticas alogénicas junto con un adyuvante y/o... [Seguir leyendo]

1. Una vacuna de células híbridas contra la Leishmaniasis que comprende un macrófago (o macrófagos) singénico con un antígeno de Leishmania Proteína-11 de la Membrana de Kinetoplástidos inmunodominante electrofusionado 5 con una célula (o células) dendrítica alogénica.

2. Una vacuna de células híbridas de acuerdo con la reivindicación, en el que el macrófago se obtiene de ratones BALB/c por métodos conocidos.

3. Una vacuna de células híbridas de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en la que la cepa de Leishmania es L. donovani a partir de la cual se obtiene el gen de la Proteína-11 de la Membrana de Kinetoplástidos antígeno de Leishmania y el antígeno comprende una proteína de superficie celular inmunodominante de la Proteína-11 de la Membrana de Kinetoplástidos de Leishmania.

4. Una vacuna de células híbridas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que la céluladendrítica alogénica se obtiene de progenitores de médula ósea o de células Dendríticas Derivadas de Médula Ósea (CDMO) obtenidas de la cepa de ratón C57BL/6.

5. Una vacuna de células hibridas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que esta provoca una respuesta inmunocelular que es una respuesta de células Th1/Th2 mixta que estimula una respuesta de linfocitos T citotóxicos CD8+ específica de la Proteína-11 de la Membrana de Kinetoplástidos.

6. Una vacuna de células híbridas de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que esta estimula una respuesta de anticuerpos, una respuesta de LCT, una respuesta proliferativa de linfocitos T, generación de IL-2,

reducción de la carga de parásitos en bazo e hígado junto con cura estéril contra Leishmania después de vacunación terapéutica a un mamífero.

7. Una formulación de vacuna híbrida contra la Leishmaniasis que comprende la vacuna de células híbridas de acuerdo con la reivindicación 1 junto con un adyuvante y/o una citocina.

8. Una formulación farmacéutica que comprende una vacuna de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores junto con un vehículo o un excipiente.

9. Un proceso para la preparación de la vacuna de células híbridas de acuerdo con la reivindicación 1, contra la 35 Leishmaniasis que comprende las siguientes etapas:

[a] aislar macrófagos de ratones BALB/c singénicos:

[b] transfectar los macrófagos obtenidos en la etapa [a] con ADNc de la Proteína-11 de la Membrana de Kinetoplástidos que contiene el vector de expresión de mamíferos pCM-LIC KMP-11;

[c] aislar células dendríticas de ratones C57BL/6 alogénicos;

[d] electrofusionar los macrófagos singénicos transfectados en la etapa [b] con células dendríticas alogénicas obtenidas en la etapa [c] para obtener células híbridas fusionadas para usar para la vacunación terapéutica contra la Leishmaniasis.

45 10. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 9 en el que la administración terapéutica de la vacuna de células híbridas es eficaz para eliminar parásitos de órganos de los mamíferos infectados con Leishmania.

11. Un proceso de acuerdo con la reivindicación 9, en el que la electrofusión es una técnica de fusión en la que semezclan dos tipos de células diferentes: [a] Macrófagos Derivados de Médula Ósea singénicos que expresan el antígeno de Leishmania y [b] células dendríticas alogénicas, a una proporción de 1:1 y después se alinean dielectroforéticamente en una cubeta cubierta con cera aplicando un voltaje de alineamiento de 50 V/cm que asciende a 20 V para una cubeta de una longitud de trayecto de 0, 4 cm optimizando entre 17 V y 25 V junto con aplicación simultánea de un voltaje de pulso cuadrático de 625 V/cm que asciende a 250 V para una cubeta de una longitud de trayecto de 0, 4 cm optimizando entre 150 V-300 V para una fusión de membrana.

12. Una formulación de vacuna híbrida de acuerdo con la reivindicación 7 para su uso en el tratamiento de Leishmaniasis, en la que la administración de la vacuna es eficaz para eliminar el parásito de los órganos de un mamífero infectado con Leishmania.

13. Una formulación de vacuna híbrida de acuerdo con la reivindicación 12 para su uso en el tratamiento de la Leishmaniasis, en el que dicha formulación se inocula, por vía intravenosa, como una serie de dosis durante un periodo de cuatro semanas y la dosis es de 5 x 105 células/100 g de peso corporal /PBS 100 μl con un intervalo de 5 días.

14. Una formulación de vacuna híbrida de acuerdo con la reivindicación 12 o reivindicación 13 para su uso en el

65 tratamiento de la Leishmaniasis en el que la administración terapéutica de la vacuna es eficaz para obtener la eliminación completa de la carga de parásitos en el bazo e hígado en la fase tardía de infección del parásito.