UN PROCESO PARA EL AISLAMIENTO DE UN OXIDANTE PRINCIPAL PERJUDICIAL DEL HUMO DE CIGARRILLO.

Un Proceso para el Aislamiento de un Oxidante Principal Perjudicial del Humo de Cigarrillo Campo de la Invención La presente invención se relaciona con un proceso para el aislamiento de p-benzosemiquinona de la fórmula 1: un oxidante principal perjudicial del humo de cigarrillo. Más particularmente la presente invención proporciona un proceso para el aislamiento de p-benzoseEmiquinona, un oxidante principal perjudicial del humo de cigarrillo, que es responsable del daño oxidativo de las proteínas y el ADN. Antecedentes de la Invención La exposición al humo de cigarrillo es la causa principal de enfermedades mortales como bronquitis, enfisema, otras enfermedades del tracto respiratorio, enfermedades cardiacas coronarias, cáncer de pulmón y otros tumores malignos [1-5]. De hecho, el humo del cigarrillo es la causa principal de cáncer de pulmón, ahora el cáncer más común a nivel mundial. Dado que los métodos para dejar el consumo del tabaco por las campañas de salud pública y las leyes contra el tabaquismo aprobadas por los Gobiernos locales han tenido éxito limitado, el método más viable es la prevención de los efectos perjudiciales provocados por el humo del cigarrillo. Se sabe que el humo del cigarrillo contiene aproximadamente 4000 componentes, de los cuales aproximadamente 3000 componentes están presentes en la fase de gas y aproximadamente 1000 componentes en la fase de alquitrán [6]. Los oxidantes en la fase de gas, tales como O- 2, H2O2, NO, el radical peroxi son extremadamente inestables [7]. Si se pasa la fase de gas en regulador de fosfato y la solución resultante se agrega a solución de albúmina, no ocurre oxidación de la proteína (7). Evidentemente, se espera que cualquier daño provocado por la fase de gas se restrinja a la cavidad bucal y el tracto respiratorio superior [8]. Por otra parte, los oxidantes presentes en el alquitrán son bastante inestables y estos son evidentemente responsables de producir daño oxidativo en el pulmón, corazón y otros órganos [7,9]. Aproximadamente 48% de los componentes de alquitrán son solubles en agua [10] y se sabe que el extracto acuoso de alquitrán produce daño oxidativo de las macromoléculas biológicas que incluyen las proteínas y el ADN [7, 11, 12]. Sin embargo, es sorprendente imaginar cómo muchos de los componentes presentes en el extracto acuoso de alquitrán son responsables de producir daño oxidativo en el sistema biológico. Hasta ahora, entre los muchos componentes del humo de cigarrillo, se ha sugerido que están implicados tres clases de compuestos como agentes causantes en el desarrollo del cáncer y enfermedades degenerativas, a saber, (i) hidrocarburos aromáticos policíclicos (ii) nitrosaminas y (iii) radicales libres. Dentro de los hidrocarburos policíclicos, el benzo [a] pireno es de hecho el mejor estudiado. Pero este no es un carcinógeno y requiere activación metabólica a través del sistema de citocromo P450 para llegar convertirse en el carcinógeno final, epóxido de benzo [a] pireno diol. Más aún, la concentración de benzo [a] pireno en humo de cigarrillo es escasa, aproximadamente 10 a 40 ng por cigarrillo [13] y el benzo [a] pireno no puede explicar el daño oxidativo de la proteína producida por el humo de cigarrillo. Entre las nitrosaminas específicas de tabaco (TSNA), las más estudiadas son N1-nitrosonomicotina (NNN) y 4- (metilnitrasamino) -1- (3-piridil) -1- butanona (NNK). De nuevo los TSNA no son carcinógenos directos y también sus concentraciones en el humo de tabaco varían ampliamente. El rango observado para NNN es 0.004 µg a 1.35 µg y para NNK, <0.004 µg a 1.75 µg por cigarrillo. Se concluye que el TSNA en el humo de cigarrillo no es un índice suficiente para el potencial carcinógeno del humo del cigarrillo [14]. De nuevo el TSNA no puede explicar el daño oxidativo de las proteínas. Otro aspecto del componente perjudicial del humo de cigarrillo es el radical libre. Pryor y sus colegas realizaron estudios considerables sobre la química de radical libre del humo de cigarrillo y sus implicaciones toxicológicas. Estos autores sugieren que el radical libre relativamente estable principal en alquitrán de cigarrillo puede ser un complejo de quinona / hidroquinona que es un sistema de oxidorreducción activo y que este sistema de oxidorreducción es capaz de reducir el oxígeno molecular para producir superóxido, que puede dar lugar a peróxido de hidrógeno y radicales hidroxilo [15], que pueden conducir eventualmente a daño oxidativo de las macromoléculas biológicas pero observamos que el daño oxidativo de las proteínas producidas por los radicales de alquitrán estables 2   no se inhibe por SOD o el catalizador indica que el daño oxidativo no está mediado por el radical de superóxido o peróxido de hidrógeno. Los solicitantes han observado adicionalmente que los radicales de alquitrán oxidan las proteínas en atmósfera de nitrógeno y en la ausencia de oxígeno molecular, lo que indica una interacción directa de los radicales de alquitrán con las micromoléculas biológicas. Sin embargo, estos autores admiten que en el radical principal han identificado en el alquitrán que actualmente no es un monorradical y probablemente no es una especie única (16). ellos también admiten que el alquitrán del cigarrillo es una mezcla increíblemente compleja y debido a que los radicales de alquitrán no se han aislado e identificado sin ambigüedades, cualquier conclusión que se relacione con la química o la bioquímica de los radicales de alquitrán se debe considerar como provisional [15]. En el documento Chemical Research in Toxicology, vol. 11, no. 5, páginas 441-448, 00-00-1998, W.A. PRYOR: "Fractionation of aqueous cigarette tar extracts: fractions that contain the tar cause DNA damage", Pryor reporta el fraccionamiento de los extractos acuosos del alquitrán de cigarrillo preparados a partir de alquitrán de cigarrillo maduro en fracciones utilizando separación de columna Sephadex. Las fracciones se analizan mediante UV y espectroscopía de resonancia paramagnética electrónica (EPR) y cromatografía de gas/espectrometría de masa (GC/MS). Pryor identifica los radicales o- y p-benzosemiquinona, sin embargo, el radical p-benzosemiquinona no se aísla ni se caracteriza en forma separada. En el documento Free Radical Biology and Medicine, vol. 27, no. 9-10, páginas 1064-1079, 00-00-1999, Koustubh Panda: "Vitamin C prevents cigarette smoke induced oxidative damage of proteins and increased proteolysis", existe una discusión de que el extracto de humo de cigarrillo contiene oxidantes estables que oxidan las proteínas de plasma humano, albúmina de suero bovino, homopolímeros de aminoácido y también provoca degradación oxidativa extensa de las proteínas microsómicas y que la vitamina C evita los oxidantes de proteínas inducidos por el humo del cigarrillo. No se ha divulgado información con respecto al aislamiento y caracterización de oxidantes perjudiciales a partir de extracto acuoso del humo de cigarrillo. Vale la pena mencionar que en la década de 1960, la industria del tabaco en general demostró en su propio laboratorio que el alquitrán del cigarrillo provoca cáncer en animales [17]. A lo largo de la década de 1960 los investigadores de las empresas trataron de descubrir los elementos tóxicos en el humo de cigarrillo con la convicción que si se pueden identificar los componentes tóxicos, estos agentes se pueden retirar o eliminar y se puede crear un cigarrillo "seguro", que suministraría nicotina sin suministrar sustancias tóxicas [17]. Pero a finales de la década de 1970, la industria del tabaco abandonó esta investigación particular, debido a que el objetivo probado resultó ser inalcanzable. Este es un problema técnicamente difícil de resolver y resultó ser intratable [17]. Muy recientemente, hemos observado que el extracto acuoso del humo de cigarrillo / alquitrán completo contiene un oxidante principal perjudicial en cantidad relativamente alta, aproximadamente 190 ± 10 µg por cigarrillo. Los solicitantes han aislado el oxidante, han determinado la estructura y encontrado que es p-benzosemiquinona. El oxidante casi cuantitativamente representa el daño oxidativo de las proteínas producidas por el extracto acuoso del humo de cigarrillo / alquitrán completo. El oxidante también es responsable de la oxidación del ADN. Nagata et al. (18) ha mostrado que los radicales semiquinona se unen al ADN y lo dañan. También se sabe que el daño oxidativo del ADN está implicado con mutación y cáncer. El oxidante es relativamente estable. Su vida útil en el estado sólido a temperatura ambiente es aproximadamente 48 horas. La presencia del oxidante estable en el humo de cigarrillo explicaría los efectos nocivos del humo colateral y tabaquismo pasivo (7). El oxidante está ausente en el tabaco no fumado y se produce durante el quemado del... [Seguir leyendo]

1. Un proceso para el aislamiento de p-benzosemiquinona de la fórmula 1, que comprende las etapas de: (Fórmula I) (a) pasar el humo de cigarrillo completo recolectado del cigarrillo con filtro convencional que tiene un contenido de alquitrán de 20-30 mg por cigarrillo en regulador de potasio 30-60 mM a pH 7.4-7.8, filtrar la solución anterior a 0.45 µm de filtro de Millipore, ajustar el pH del filtrado que varía entre 7.4 a 7.6 al agregar solución de NaOH para obtener la solución de humo de cigarrillo deseada (solución cs); (b) extraer dicha solución cs anterior tres veces con igual volumen de cloruro de metileno, descargar la capa de cloruro de metileno inferior y recolectar la capa acuosa de color amarillo superior denominada como extracto acuoso de humo de cigarrillo; (c) extraer dicha capa acuosa anterior de humo de cigarrillo dos veces con igual volumen de n-butanol saturado con agua, liofilizar el extracto de butanol amarillo agrupado en un liofilizador Lyolab en una temperatura que varía entre - 50° C a -60° C bajo vacío seguido por la extracción del material liofilizado dos veces con acetona grado HPLC y secar la solución de acetona bajo vacío y disolver en dicho extracto de acetona con metanol grado HPLC; (d) someter dicha solución de metanol anterior a TLC de banda utilizando placas de sílice no fluorescentes, desarrollar dichas placas de sílice utilizando una mezcla de tolueno y acetato de etilo en una relación de 80:20, sacar la placa y secar de aproximadamente 25°C a 30°C utilizando un secador, cortar pequeñas tiras que contienen el material desarollado desde ambos lados de las placas y mantenerlas en una cámara de yodo para la ubicación de la banda que corresponde a Rf 0.26, raspar la banda y extraer el material de banda con acetona grado HPLC seguido por recolección de la capa de acetona y secarla bajo vacío; (e) disolver dicho extracto de acetona anterior que aparece como agujas amarillas pálidas al agregar volumen igual de agua milli Q, extraer la solución acuosa con igual volumen de n-butanol saturado con agua grado HPLC seguido por secado de la capa superior de n-butanol en pequeños tubos de vidrio bajo vacío para obtener el oxidante cs principal con una pureza de 98-99% y rendimiento de 18-22 µg por cigarrillo; y (f) purificar dicho oxidante cs anterior como se obtiene en la etapa e al disolverlo en un solvente móvil que comprende una mezcla de cloruro de metileno y metanol en una relación de 90:10 (v/v) e inyectarlo en un instrumento HPLC con una columna de sílice de 25 cm de fase normal utilizando un detector uv a 294 nm en un índice de flujo de 0.5 ml/min, en una temperatura de aproximadamente 25° C, en una presión de aproximadamente 29 kgf/cm 2 y recolectar el efluente que aparece como un pico único en un tiempo de retención de 8.808 min con una pureza de 100% y rendimiento de 8.4% del oxidante cs total presente en la solución cs progenitora. 2. Un proceso para el aislamiento de p-benzosemiquinona de acuerdo con la reivindicación 1 en donde el alquitrán o la solución cs se obtiene al encender un cigarrillo y recolectar el humo en un matraz de vidrio sumergido en una mezcla de hielo y sal que deja condensar el alquitrán y se deposita en el fondo del matraz, y se lleva a cabo la extracción con dicho matraz anterior a temperatura ambiente. 3. Un proceso como se reivindica en las reivindicaciones 1 a 2, en donde p-benzosemiquinona presente en la solución cs se evalúa cuantitativamente mediante HPLC con un detector UV utilizando una columna ODS de fase inversa de 25 cm y utilizando una mezcla de agua y metanol (95:5 v/v) como una fase móvil, en una longitud de onda de 288 nm, índice de flujo de 0.8 ml/min, en una temperatura de aproximadamente 25°C y en una presión de aproximadamente 147 Kgf/cm 2 y que tiene un tiempo de retención de 13.46 min. 4. Un proceso como se reivindica en la reivindicación 1, en donde el daño de las proteínas originado por pbenzosemiquinona presente en la solución cs se determina cuantitativamente al medir la formación de carbonilo de 13   proteína al hacer reaccionar la proteína con p-benzosemiquinona obtenida de la solución cs, seguido por reacción con 2,4 dinitrofenil hidrazina (DNPH) y finalmente medir la absorbancia en una longitud de onda de 390 nm. 5. Un proceso como se reivindica en la reivindicación 1, en donde el daño de las proteínas originado por pbenzosemiquinona presente en la solución cs se determina cuantitativamente al medir la degradación oxidativa de proteínas microsómicas de tejido de conejillo de indias al hacer reaccionar dicha proteína con p-benzosemiquinona presente en la solución cs seguido por SDS-PAGE y barrido densitométrica. 6. Un proceso como se reivindica en la reivindicación 5, en donde la proteína utilizada para el ensayo de daños oxidativos de la proteína se selecciona del grupo que consiste de BSA y proteínas microsómicas de pulmón de conejillo de indias. 7. Un proceso como se reivindica en la reivindicación 1, en donde dicho método se utiliza para la determinación cuantitativa de p-benzosemiquinona oxidante cs en cigarrillos con base en el contenido de alquitrán de la marca comercial particular del cigarrillo. 8. Un proceso como se reivindica en la reivindicación 1, en donde dicho método se utiliza para la determinación cuantitativa de p-benzosemiquinona oxidante cs en cigarrillos con base en el nivel de toxicidad de la marca comercial particular del cigarrillo. 9. Un proceso como se reivindica en la reivindicación 1, en donde la cantidad de p-benzosemiquinona aislada de cigarrillo de diferentes marcas comerciales de cigarrillos quemados se utiliza para determinar el índice de toxicidad de una marca particular de cigarrillo con base en la cantidad de p-benzosemiquinona presente. 14     16   17   18   19     21   22   23   24     26   27   28   29     31   32   33   34     36   37   38   39     41   42   43   44     46   47   48   49