Variantes de la interleucina-12p40 con estabilidad mejorada.

Una variante de la IL-12p40 que comprende una sustitución o deleción de un aminoácido en una o más posiciones,

correspondientes a las posiciones 258-266 de la IL-12 p40 humana madura parental, en donde la variante comprende sustituciones en las posiciones Lys260, Ser259 y Arg261.

Variantes de la interleucina-12p40 con estabilidad mejorada.

Área de la invención.

La presente invención hace referencia, en general, a proteínas de IL-12p40, incluyendo proteínas de fusión que contengan IL-12p40, modificadas para mejorar su estabilidad. En particular, las proteínas IL-12p40 de la invención eliminan un sitio proteolítico en la región de Lys260 y Arg261 en la subunidad p40.

Antecedentes de la invención.

La interleucina-12 (IL-12) es una citocina inflamatoria que se produce, en respuesta a la infección, por parte de una variedad de células del sistema inmunológico, incluyendo células fagocíticas, linfocitos B y células dendríticas activadas (Colombo y Trinchiero (2002) , Cytokine & Growth Factor Reviews (Informes sobre Citocinas y Factor de Crecimiento) 13: 155-168) . La IL-12 desempeña un papel esencial en la mediación de la interacción de las armas innatas y adaptativas del sistema inmunológico, actuando sobre los linfocitos T y las células asesinas naturales (NK, por sus siglas en inglés) , aumentando la proliferación y actividad de los linfocitos citotóxicos y la producción de otras citocinas inflamatorias, especialmente el interferón-y (IFN-y) .

La IL-12 es una mólecula heterodimérica compuesta de una cadena a (la subunidad p35, IL-12p35) y una cadena º (la subunidad p40, IL-12p40) , enlazadas de forma covalente mediante un puente disulfuro para formar el heterodímero de 74 kDa biológicamente activo. Las secuencias de aminoácidos de la IL-12p35 y de la IL-12p40 de una IL-12 humana madura (tipo silvestre) , se encuentran representadas en las Figuras 1 (SEQ ID NO:1) y 2 (SEQ ID NO:2) , respectivamente.

La interleucina-23 (IL-23) es una molécula heterodimérica con puente de disulfuro, estrechamente relacionada con la IL-12, en el sentido en que presenta la misma cadena º de IL-12p40 que la IL-12, pero una única cadena a (la subunidad p 19, IL-23p19) (Oppmann et al., (2000) , Immunity (Inmunidad) , 13: 715-725) . Al igual que la IL-12, la IL23 es producida por células fagocíticas y células dendríticas activadas, y se cree que está implicada en el reclutamiento y activación de una serie de células inflamatorias (Langrish et al., (2004) Immuno/. Rev., 202: 96-105) . La secuencia de aminoácidos de la IL-23p19 de una IL-23 humana madura se representa en la Figura 3 (SEQ ID NO:3) .

Para que los inmunocitos secreten heterodímeros de IL-12 o IL-23 biológicamente activos, se requiere la expresión concomitante de las subunidades a y º en la misma célula. La secreción únicamente de la IL-12p35 o IL-23p19 por parte de los inmunocitos no se ha observado, mientras que las células que producen el heterodímero de IL-12 o IL23 biológicamente activo secretan la subunidad p40, de forma libre, en un valor superior de 10 a 100 veces por encima del heterodímero (D'Andrea et al. (1992) , J. Exp. Med., 176: 1387-98, Oppmann et al., (2000) , Immunity, 13: 715-725) . Además, se ha observado en ratones que, incluso en la ausencia de una subunidad a, las células pueden producir un homodímero de IL-12p40 biológicamente activo (Hikawa et al. (2004) , Neuroscience (Neurociencia) , 129: 75-83) .

La presencia de IL-12 endógena ha mostrado ser necesaria para la resistencia inmunológica a un amplio conjunto de patógenos, además de a tumores transplantados y químicamente inducidos (Gately et al. (1998) , Annu. Rev. Immunol., 16: 495-521) . Se ha demostrado que la IL-12 presenta una potente actividad antitumoral basada en la inducción del IFN-y y la activación de las células efectoras, tales como CD8+ linfocitos T y células NK (Brunda et al. (1993) , J. Exp. Med., 178: 1223-30) . Como resultado de su demostrada actividad antitumoral, la IL-12 ha sido probada en ensayos clínicos humanos como un agente inmonoterapéutico para el tratamiento de una amplia variedad de tipos de cáncer (Atkins et al. (1997) , Clin. CancerRes., 3: 409-17; Gollob et al. (2000) , Clin. Cancer Res., 6: 1678-92; y Hurteau et al. (2001) . Gynecol. Oncol., 82: 7-10) , incluyendo cáncer renal, cáncer de colon, cáncer de ovarios, melanoma y linfoma de linfocitos T, y es un adyuvante para vacunas contra el cáncer (Lee et al. (2001) , J. Clin. Oncol. 19: 3836-47) .

Para la IL-12 o la IL-23, la producción de proteína recombinante en su forma heterodimérica correctamente plegada y biológicamente activa, requiere de la expresión concurrente tanto de la subunidad a, como de la IL-12p40 en la línea de producción celular. La proteína recombinante purificada, sin embargo, muestra un grado de heterogeneidad que es el resultado del corte proteolítico en la región C-terminal de la IL-12p40. La inestabilidad de la proteína IL-12

o IL-23 puede dar lugar a problemas en su producción y uso clínico como agente terapéutico. Por lo tanto, existe la necesidad en el estado del arte de variantes mejoradas recombinantes de IL-12 o IL-23 que produzcan una proteína homogénea más resistente al corte proteolítico.

Resumen de la Invención.

La invención proporciona variantes de las subunidades de la IL-12p40 humana (variantes de p40) que han mejorado su estabilidad, en comparación con las proteínas IL-12p40 de tipo silvestre. En estas variantes de p40, la región Cterminal, que es, de manera habitual, sensible al corte proteolítico, ha sido modificada para ser más resistente a la digestión por parte de las proteasas. De manera específica, las variantes de p40 de la invención incluyen modificaciones en el diseño de los aminoácidos en el dominio D3, destinadas a evitar la creación de epítopos de linfocitos T potenciales que podrían hacer que las proteínas variantes se vuelvan inmunogénicas y desencadenar respuestas de anticuerpos en humanos. Como resultado, las variantes de p40 de la invención han mejorado sus propiedades como agentes terapéuticos sobre las proteínas IL-12p40 de tipo silvestre en referencia a su producción, formulación, y farmacocinética.

Por consiguiente, en un aspecto, la presente invención proporciona variantes de la IL-12 p40 humana con una modificación de aminoácidos en una o más posiciones que corresponden a los residuos 258-266 de IL-12 p40 humana madura. Ciertas realizaciones de la presente invención están basadas, en parte, en la apreciación de que una modificación o modificaciones de aminoácidos de acuerdo a la invención, presenta el beneficio en particular de eliminar el sitio proteolítico entre Lys260 y Arg261.

De acuerdo a la presente invención, las modificaciones de aminoácidos en una o más posiciones correspondientes a los residuos 258-266 pueden ser deleciones, sustituciones, o inserciones. Más aún, las sustituciones de aminoácidos que reemplazan aminoácidos básicos con aminoácidos no básicos, pueden ser utilizadas para crear variantes de acuerdo a la invención.

De acuerdo a la invención, las variantes comprenden sustituciones al menos en las posiciones Lys260, ser259 y Arg261. En particular, las variantes de la invención presentan las sustituciones Ser259Asp. Lys260Asn, y Arg261Thr. En una realización adicional, las variantes de la invención incoporan las sustituciones Ser259Asp, Lys260Asn, Arg261Thr y Lys264Gly, mientras que suprimen Lys263 y Asp265. De manera alternativa, una variante de la presente invención incorpora las sustituciones Ser259Asp, Lys260Asn, Arg261Thr, y Lys264Gly, mientras que suprime Lys263, Lys264 y Asp265.

En otras realizaciones de acuerdo a la invención, una variante que incluye una sustitución que reemplaza a Lys260, incluye, de manera alternativa, sustituciones adicionales en uno o más de Lys258, Seer259, Arg261, Lys263, y Lys264. Por ejemplo, en una realización, una variante incluye las sustituciones Lys258Gln, Ser259Asp, Lys260Gln, Arg261Asp, y de manera opcional Lys263Ser y Lys264Gly.

En realizaciones adicionales, además de las sustituciones en Ser259, Lys260, y Arg261, uno o más residuos correspondientes a Lys263, Lys264, Asp265, y Arg266 se suprimen, mientras que en otra realización, uno o más de Lys263, Lys264, Asp265, y Arg266 se sustituyen con un aminoácido no básico. En una realización adicional, la sustitución en Lys264 es Lys264Gly y, de manera opcional, Lys263 y Asp265 se suprimen.

Debe entenderse por aquellos expertos en el arte que las variantes de p40 y las porciones activas de las mismas que incorporen una variante tal como se describe en el presente documento, se encuentran en el alcance de la presente invención. De manera similar, las proteínas IL-12 y las porciones activas de las mismas que contienen una... [Seguir leyendo]

1. Una variante de la IL-12p40 que comprende una sustitución o deleción de un aminoácido en una o más posiciones, correspondientes a las posicione.

25. 266 de la IL-12 p40 humana madura parental, en donde la variante comprende sustituciones en las posiciones Lys260, Ser259 y Arg261.

2. Una variante de la reivindicación 1, que comprende las sustituciones Ser259Asp, Lys260Asn, y Arg261 Thr.

3. Una variante de la reivindicación 2, que además comprende la sustitución Lys264Gly.

4. Una variante de la reivindicación 3, en donde además uno o ambos de los residuos Lys263 y Asp265 son eliminados.

5. Una variante de la reivindicación 1 ó 2, en donde uno o más residuos correspondientes a Lys263, Lys264, Asp 265, y Arg266 son eliminados.

6. Una variante de la reivindicación 1 ó 2, que además comprende una o más sustituciones seleccionadas del grupo que consiste en Lys263, Lys264, Asp 265, y Arg266, en donde el correspondiente residuo de aminoácido original es reemplazado por un aminoácido no básico.

7. Una variante de la reivindicación 1, que comprende

(i) las siguientes sustituciones: Ser259Asp, Lys260Asn, y Arg261Thr, y

(ii) las siguientes deleciones: Lys263, Lys264 y Asp265, en donde dichas posiciones están relacionadas con la molécula modificada de tipo silvestre, formando de ese modo la formación de secuencia Lys - Asp - Asn - Thr - Glu - Arg en las posiciones 258 -

263 de la variante.

8. Una variante de la reivindicación 1, que comprende

(i) las siguientes sustituciones: Ser259Asp, Lys260Asn, Arg261Thr, y Lys264Gly, y

(ii) las siguientes deleciones: Lys263 y Asp265, en donde dichas posiciones están relacionadas con la molécula modificada de tipo silvestre, formando de ese modo la formación de secuencia: Lys - Asp - Asn - Thr - Glu - Gly - Arg en las posiciones

258-264 de la variante.

9. Una variante de la reivindicación 1, que comprende las siguientes sustituciones: Lys258Gln, Ser259Asp, Lys260Gln, Arg261Asp, formando de ese modo la formación de secuencia: Gin - Asp - Gin - Asp - Glu - Lys - Lys - Arg en las

posicione.

25. 265 de la variante.

10. Una variante de la reivindicación 1, que comprende las siguientes sustituciones: Lys258GIn, Ser259Asp, Lys260Gln, Arg261Asp, Lys263Ser, Lys264Gly, formando de ese modo la formación de secuencia: Gln -Asp - Gln - Asp - Glu - Ser- Gly - Arg en las

posiciones 258 - 265 de la variante.

11. Una proteína IL-12 o un fragmento de la misma que contiene la variante de cualquiera de las reivindicaciones 1 -

10.

12. Una proteína IL-23 o un fragmento de la misma que contiene la variante de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 13

13. Una proteína de fusión que comprende una variante de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 10, o una proteína de la reivindicación 11 ó 12, y un anticuerpo o una porción activa del mismo.

14. Una proteína de fusión de la reivindicación 13, en donde dicha variante o dicha proteína se fusiona al C-terminal de dicho anticuerpo o porción de anticuerpo.

15. Un ácido nucleico que codifica una variante de acuerdo con cualquiera de la reivindicación 1 - 10, o una proteína de las reivindicaciones 11 ó 12, o una proteína de fusión de la reivindicación 13 ó 14.

16. Un vector de expresión que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 15.

17. Una célula hospedadora que produce una variante de acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 - 10, o una

proteína de la reivindicación 11 ó 12, o una proteína de fusión de la reivindicación 13 ó 14, que comprende el vector 10 de expresión de la reivindicación 16.

18. Una composición farmacéutica que comprende en una cantidad farmacológicamente efectiva una proteína o una proteína de fusión de cualquiera de las reivindicaciones 11 - 14, de manera opcional junto con un diluyente o excipiente portador aceptable farmaceúticamente.

19. Una composición farmacéutica de la reivindicación 18 para su uso para el tratamiento del cáncer o de una 15 enfermedad autoinmune.