VACUNA PARA PREVENIR Y TRATAR LA RINITIS ATRÓFICA PROGRESIVA PORCINA.

Vacuna para prevenir y tratar la rinitis atrófica progresiva porcina ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN 1. CAMPO DE LA INVENCIÓN [0001] La presente invención está, en general, en el campo de las vacunas veterinarias, composiciones de vacuna y procedimientos de producir las mismas. Particularmente, en el presente documento se proporcionan las vacunas para inmunizar animales contra la rinitis atrófica progresiva (RAP), que comprende una combinación de tres fragmentos de toxinas de subunidades recombinantes de Pasteurella multocida (rsPMT), cada uno con una secuencia de aminoácidos que corresponde a los residuos de aminoácidos 2-486, 486-986 o 986-1281 de la toxina de Pasteurella multocida (PMT). 2. DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA [0002] La riñita atrófica progresiva (RAP) es una importante enfermedad de las vías respiratorias altas en cerdos. Las lesiones características incluyen hipoplasia ósea turbinaza, distorsión facial y hemorragia nasal como consecuencia de los frecuentes estornudos. Además, la RAP produce una significativa pérdida económica global en la producción de cerdos debido al retraso del crecimiento. En varios estudios se ha demostrado que la toxina de Pasteurella multocida (PMT) es el principal factor de virulencia responsable de la atrofia turbinaza que se ve en la RAP (véase, por ejemplo, Ackermann MR y col. 1996; Am J Vet Res 57(6):848-852; y Lax AJ & Chanter N. 1990; J Gen Microbiol 136:81-87). La inoculación de PMT sola podría reproducir todos los síntomas principales de la RAP en cerdos expuestos de forma experimental. La PMT, en aerosol o inyectada en los cerdos, produce una atrofia turbinaza grave y reduce la ganancia de peso (Kamp EM & Kimman TG 1988; Am. J. Vet. Res. 49:1844-1849). Los mecanismos por los cuales la PMT reduce la ganancia de peso y la atrofia ósea conchal se han estudiado extensamente. Los resultados de varios estudios indican que la PMT podría incrementar la resorción ósea y reducir la formación de hueso alterando las funciones de los osteoblastos y los osteoclastos. [0003] La base molecular de la virulencia de la PMT sigue sin estar clara, pero puede estar asociada con la activación de los osteoclastos o inactivación de los osteoblastos. Se ha demostrado que la PMT es un potente mitógeno para varios tipos de células, como los fibroblastos 3T3 de cerdo. La PMT podía inducir una estimulación semimáxima de la síntesis de ADN y la proliferación celular a dosis tan bajas como 1 pM. El efecto de la PMT sobre los osteoclastos y osteoblastos porciones se ha investigado usando un sistema de cultivo celular in vitro. La exposición de las células de médula ósea a la vitamina F3 y a PMT durante el crecimiento condujo a un incremento del número de células y la aparición temprana de los osteoclastos en comparación con los controles. Las concentraciones bajas de PMT dieron como resultado retraso del crecimiento u disminución de la formación de nódulos en los osteoblastos, mientras que las concentraciones altas de PMT aumentaron la muerte celular e inhibieron la formación de módulos (Gwaltney SM y col. 1997; Vet Pathol 34(5):421-430). PMT también estimula la proliferación celular, pero afecta a la maduración celular y a la función celular en cultivos primarios de osteoblastos de rata. Estos hallazgos sugieren que PMT pueden incrementar la resorción ósea y disminuir la aposición ósea, lo que, en última instancia, conduce a osteólisis progresiva y a atrofia ósea continua. [0004] Muchos posibles patógenos bacterianos pueden colonizar la cavidad nasal o las amígdalas de cerdos y P. multocida es uno de los principales patógenos oportunistas capaces de producir el complejo de enfermedad respiratoria porcina (CERP). De hecho, la RAP se considera una enfermedad respiratoria contagiosa con una elevada prevalecía en las áreas del mundo en la que se practica la cría moderna de cerdos. Los antibióticos, la vacunación y la buena gestión pueden reducir la gravedad y la frecuencia de la RAP. No obstante, el uso excesivo de antibióticos es una fuente de problemas para la salud pública y la vacunación ha surgido como el abordaje más atractivo en el control de la RAP (Foged NT y col. Vet Rec 1989; 125(1):7-11; Kobisch M, Pennings A, Vet Rec 1989; 124 (3):57-61; y Sakano T y col. J Vet Med Sci 1997; 59(1):55-57). [0005] La totalidad del gen de PMT (toxA) que codifica una proteína de 1285 aminoácidos se ha clonado y expresado en E. coli (Petersen SK & Foged NT 1989; Infect Immun 57(12):3907-3913). Se ha demostrado que un derivado de PMT recombinante que carece de los residuos de aminoácidos 27-147 en N-terminal induce una respuesta protectora contra la exposición a una dosis letal de PMT en ratones (Petersen SK y col. 1991; Infect Immun 59(4):1387-1393), y que reduce la colonización por P. multocida toxigénica en las narinas y amígdalas de los cerdos (Nielsen JP y col. 1991; Can J Vet Res 55(2):128-138). Por tanto, los derivados de PMT recombinantes pueden servir como inmunógenos ideales para producir una buena respuesta protectora sin causar citotoxicidad en animales. [0006] La formalina es el reactivo más frecuente usado para inactivar la PMT, pero puede inducir alteraciones químicas que pueden reducir la inmunogenicidad o la eficacia de las vacunas (Nielsen JP y col. 1991; como se ha descrito). Por tanto, un derivado de PMT no tóxico pero inmunogénico podría ser ventajoso para el desarrollo de 2   vacunas eficaces contra la RAP. La mayoría de las vacunas contra la RAP probadas hasta la fecha consisten en cultivos inactivados de P. multocida o de toxoides de PMT. Los toxoides se preparan mediante el tratamiento de PMT con formaldehído, que elimina la toxicidad manteniendo la antigenicidad. Estas vacunas para la RAP son eficaces cuando se prueban en granjas. No obstante, PMT constituye menos del 0,6 % de las proteínas celulares de P. multocida, lo que hace necesario cultivar una gran cantidad de bacterias con el fin de obtener suficiente antígeno para usar a escala comercial. Las vacunas con toxoide tradicionales requieren el cultivo a gran escala de una cepa toxigénica de P. multocida y un procedimiento tedioso y caro para la preparación del toxoide de PMT. Además de requerir tiempo y ser caro, la necesidad de usar reactivos inactivantes, tales como formaldehído, puede inducir alteraciones químicas incontrolables en la inmunogenicidad de proteínas que pueden reducir o eliminar la eficacia de dichas vacunas. [0007] La porción en N-terminal de PMT (residuos 1 a 506 a.a.) se ha considerado que contiene el supuesto dominio de unión a la célula y el dominio de translocación. La inmunización de rsPMT Tox1 en N-terminal (Residuos 1 a 487 aa) podría producir anticuerpos neutralizantes que podrían impedir la unión de PMT a las células diana y, posteriormente, su translocación a través de la membrana celular. En consecuencia, se bloqueó la actividad de PMT. Además, se ha sugerido que la porción en C-terminal de PMT era el dominio catalítico y los anticuerpos producidos contra los fragmentos en C-terminal (residuos residuos 681-1285 y 849-1285) eran capaces de inhibir el efecto mitogénico de PMT. Se demostró que los residuos 1165 (cisteína), 1205 (histidina) y 1223 (histidina) eran esenciales para la actividad intracelular de PMT (Baldwin MR y col. 2004; 54(1):239-250; y Pullinger GD y col. 2001; Infect. Immun. 69: 7839-7850). Los derivados de rsPMT son fáciles de producir y no son citotóxicos, de modo que no se requiere una inactivación química adicional antes de usar. La patente de EE.UU. nº 6.110.470 divulgó los derivados polipeptídicos de la toxina de P. multocida, que comprende las secuencias de aminoácidos idénticas a PMT pero carece de los aminoácidos 1043-1130 o carece de los aminoácidos 1130-1285. [0008] Así, en la presente invención se producen tres derivados de la subunidad recombinante de PMT (rsPMT), que representan las porciones en N-terminal (aa. 2-486), del centro (aa. 486-986) y C-terminal (aa. 986-1281) de PMT, y sus inmunogenicidades se caracterizan evaluando el nivel de células secretoras de anticuerpos específicos de PMT, los títulos de anticuerpos neutralizantes en suero y el grado de proliferación linfocitaria en ratones y cerdos inmunizados. La eficacia de estas subunidades recombinantes como vacuna se evaluó en cerdas preñadas y su descendencia mediante el análisis de los títulos de anticuerpos neutralizantes en el calostro y el suero, y mediante monitorización de la tasa de supervivencia y la ganancia de peso medio en lechones tras la exposición a PMT. RESUMEN DE LA INVENCIÓN [0009] Un aspecto de la presente invención es proporcionar una vacunas para inmunizar animales contra la rinitis atrófica progresiva (RAP), que comprende una combinación de tres proteínas, comprendiendo cada uno de ellas un fragmento de toxinas de subunidades recombinantes de Pasteurella... [Seguir leyendo]

1. Una vacuna para inmunizar un animal contra la rinitis atrófica progresiva (RAP), que comprende una combinación de tres proteínas, cada una de ellas comprendiendo solamente un fragmento de una toxina de Pasteurella multocida (rsPMT), en donde el fragmento consiste en la secuencia de aminoácidos de los residuos de aminoácidos 2-486, 486-986 y 986-1281 de SEC ID Nº 2, respectivamente. 2. La vacuna de la reivindicación 1, en la que los fragmentos de PMT derivan de toxinas de Pasteurella multocida de subunidad recombinante (rsPMT) de un aislado con serotipo D. 3. La vacuna de la reivindicación 1, en la que cada fragmento de rsPMT se produce mediante tecnología de ADN recombinante. 4. La vacuna de la reivindicación 3, en la que cada fragmento de rsPMT se expresa en un transformante de E. coli con un plásmido que comprende la secuencia codificante del fragmento 2-486, 486-986 y/o 986-1281 de la toxina de Pasteurella multocida. 5. La vacuna de la reivindicación 1, que además comprende al menos un antígeno derivado del toxoide de PMT, de Pasteurella multocida de serotipo A, de Pasteurella multocida de serotipo D o de Bordetella bronchiseptica. 6. La vacuna de la reivindicación 1, que además comprende al menos un adyuvante seleccionado de adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, gel de aluminio, adyuvante oleoso (A/Ac/A), emulsión de agua en aceite, A/Ac; emulsión de aceite en agua, Ac/A, Con A, ß-glucosano y una combinación de los mismos. 7. Una vacuna multivalente contra la rinitis atrófica progresiva (RAP), que comprende una combinación de las tres proteínas de la reivindicación 1 como primer componente; y al menos un antígeno o epítopo asociado con otra patología animal. 8. La vacuna multivalente de la reivindicación 7, que comprende el virus de la seudorabia (PR) inactivado con deleción de gE como segundo componente. 9. La vacuna multivalente de la reivindicación 7, que además comprende al menos un antígeno derivado del toxoide de PMT, de Pasteurella multocida de serotipo A, de Pasteurella multocida de serotipo D o de Bordetella bronchiseptica. 10. La vacuna multivalente de la reivindicación 7, que además comprende al menos un adyuvante seleccionado de adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, gel de aluminio, adyuvante oleoso (A/Ac/A), emulsión de agua en aceite, A/Ac; emulsión de aceite en agua, Ac/A, Con A, ß-glucosano y una combinación de los mismos. 11. La vacuna multivalente de la reivindicación 7, en la que los fragmentos de PMT derivan de las toxinas de Pasteurella multocida de subunidad recombinant (rsPMT) de un aislado con serotipo D. 12. La vacuna multivalente de la reivindicación 8, en la que los fragmentos de PMT y de PR se producen mediante tecnología de ADN recombinante. 31   32   33   34     36   37   38   REFERENCIAS CITADAS EN LA DESCRIPCIÓN Esta lista de referencias citadas por el solicitante es únicamente para la comodidad del lector. No forma parte del documento de la patente europea. A pesar del cuidado tenido en la recopilación de las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la EPO niega toda responsabilidad en este sentido. Documentos de patentes citados en la descripción Literatura diferente de patentes citada en la descripción 39