USO DE IL-7 E IL-15 PARA LA MODIFICACIÓN DE LOS LINFOCITOS T DE MEMORIA.

Uso de IL-7 e IL-15 para la modificación genética de los linfocitos T de memoria INTRODUCCIÓN El repertorio de células T con especificidad de antígeno (Ag) está estrechamente regulado por mecanismos homeostáticos que aseguran su persistencia y funcionalidad incluso en ausencia del antígeno. Después de encontrarse con un Ag, las células T naíf sufren una expansión clonal rápida y se diferencian en células T efectoras (1, 2). La duración de vida de las células T efectoras está limitada por la muerte celular que puede ocurrir después de encontrar un Ag adicional (muerte celular inducida por activación) o debido a la ausencia de factores de supervivencia. Durante una respuesta inmune, se generan también células T de memoria. Las células T de memoria pueden sobrevivir durante toda la vida, proporcionando así una protección de larga duración contra los patógenos de recuerdo (3). Las frecuencias de células T de memoria con especificidad de antígeno en la mayoría de las muestras biológicas, sin embargo, siguen siendo inferiores al límite de detección de los ensayos de tinción del tetrámero Ag/MHC (Complejo Mayor de Histocompatibilidad) y ensayos funcionales, tales como la tinción de citoquinas intracelulares y ELISpot (4, 5). Las células T CD4' con especificidad de Ag en particular son en su mayoría indetectables ex vivo y por consiguiente se analizan después de tandas múltiples de expansión de las células T in vitro impulsada por Ag. La reestimulación in vitro, sin embargo, favorece probablemente la diferenciación terminal de las células, dificultando su supervivencia a largo plazo. Como consecuencia, las células T re-estimuladas por Ag in vitro podrían exhibir también un fenotipo no totalmente representativo del encontrado in vivo. Por estas razones, son necesarias estrategias alternativas que mejoren la detección ex vivo de las células T con especificidad de Ag a fin de caracterizar mejor las respuestas inmunes en curso, y evaluar la inmunocompetencia de pacientes con trastornos relacionados con la inmunidad. Varios estudios han demostrado que el establecimiento y el mantenimiento de la memoria de las células T están controlados por señales dirigidas asociadas con las células (complejo Ag/MHC) y solubles (citoquinas) (3, 6, 7). El disparo del TCR por complejos Ag/MHC propios y extraños regula la transición de las células naíf a células de memoria, la supervivencia y la proliferación de las células de memoria. El conjunto de linfocitos de memoria es posiblemente muy heterogéneo. Recientemente, se han identificado dos tipos de células T de memoria: las células T de memoria efectoras (CD45RA-, CCR7-, CD62L-) y las células T de memoria central que son células CD45RA negativas caracterizadas por la expresión de CCR7 y CD62L, dos moléculas requeridas para el asentamiento en áreas de células T de órganos linfoides secundarios. Después de la estimulación con un antígeno, las células T de memoria central producen niveles bajos de citoquinas efectoras tales como IL-4 e IFN-, pero niveles altos de IL-2, que es capaz de sostener su proliferación rápida y consistente. Después de encontrarse con un antígeno, las células T de memoria central experimentan: 1) proliferación, dando como resultado un proceso auto-regenerativo, encaminado a aumentar su reserva, y 2) diferenciación, que da como resultado la generación de células T de memoria efectoras, que se caracterizan por un bajo potencial proliferativo pero son capaces de migrar a tejidos inflamados no linfoides y mediar la fase efectora de la respuesta inmune (8). La retirada del Ag es crítica para evitar una estimulación excesiva del TCR y la muerte celular inducida por activación, y para la generación de células T de memoria central. La homeostasis apropiada de las células T está asegurada por citoquinas que regulan estrechamente la supervivencia, proliferación y apoptosis de los linfocitos T humanos y murinos. Entre los factores solubles, las citoquinas comunes de fijación de la cadena tales como IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 e IL-21 promueven la supervivencia celular y la proliferación homeostática (2). En particular, IL-2 sostiene a la vez la proliferación de las células T y la apoptosis después del encuentro con un antígeno. Las señales generadas por TCR y por IL-7 controlan la proliferación y supervivencia de las células naíf y de memoria (7, 9-14). En ausencia de intervención del TCR, IL-7 hace las células T CD4+ maduras humanas naíf y de memoria menos susceptibles a la muerte celular inducida por Fas (15). Además, por inducir la regulación creciente de Bcl-2, favorece la transición de las células T CD4+ con experiencia de Ag a células de memoria en reposo (9, 11). Finalmente, IL-15 combina una actividad anti- apoptótica con un efecto consistente de promoción de la proliferación de células T naíf y de memoria (16). Por estas razones, las citoquinas de fijación de la cadena comunes han sido utilizadas con anterioridad en combinación con la expansión de las células dirigida por Ag para el mantenimiento y la expansión in vitro de líneas de células T con especificidad de Ag. En algunos casos se utilizaron también citoquinas comunes de fijación de la cadena para mejorar la detección de células T con especificidad de Ag. La publicación de patente de los Estados Unidos US2005/0074822 se refiere a un método de detección de una población de células T con especificidad de antígeno en el cual las células se exponen al antígeno en presencia de citoquinas comunes de fijación de la cadena . Este método no permite la expansión , o el enriquecimiento, de células de memoria con especificidad de Ag. Varios documentos (44-49) describen la activación de linfocitos con baCD3/CD28 y sus exposición a IL-2 y/o IL-7 dentro del contexto de la transducción de células T. 2   DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Modelo 3. Esta invención está basada en el concepto de que las células de memoria central, después del disparo del TCR en presencia de co-estimulación y cultivo con gamma-citoquinas, pueden expandirse in vitro y ser modificadas genéticamente por un vector viral, en tanto que mantienen sus fenotipos funcionales. Se cree que la terapia celular con linfocitos T tiene un enorme potencial para curar cánceres, infecciones, inmunodeficiencias y autoinmunidad. Además, la misma puede utilizarse para modular las respuestas inmunes que se producen en el contexto del trasplante. La modificación genética está orientada a ensanchar el intervalo terapéutico de los linfocitos T por aumento de su eficacia y/o limitación de su toxicidad. Esto se consigue por la transferencia de genes que codifican nuevos receptores, productos biológicamente activos, factores de resistencia y de control. Se espera que los factores de control proporcionen eliminación/desactivación selectivas in vivo de células modificadas genéticamente si sobreviene un efecto tóxico/indeseable. La terapia con genes suicidas en el contexto del trasplante alogénico de células hematopoyéticas (alo-HCT) es el ejemplo más claro del modo en que la modificación genética de células T con un factor de control logra un beneficio terapéutico. En la alo-HCT, el reconocimiento inmune de antígenos del hospedador por las células T del donante es un arma "de doble filo", que conduce a efectos beneficiosos específicos: las células T 1) median un efecto antitumoral directo (injerto-frente a-leucemia-GvL); 2) promueven el injerto de precursores hematopoyéticos; 3) proporcionan un sistema inmune intacto a los pacientes trasplantados, haciendo así posible que remitan la incidencia y la gravedad de las infecciones post-trasplante. Lamentablemente, las células T del donante pueden reaccionar también contra los tejidos sanos del hospedador, conduciendo así a la enfermedad de rechazo inverso ( la GvHD), amenazante para la vida (20). La modificación genética de las células T con un vector retroviral que expresa el gen suicida de la timidina-quinasa (TK) del Virus del Herpes Simplex confiere sensibilidad selectiva al pro-fármaco ganciclovir (GCV). En los pacientes, la infusión de linfocitos TK + y la administración subsiguiente de GCV dieron como resultado una modulación a lo largo del tiempo de la reactividad anti-hospedador para la preservación de los beneficios de las células T, y un control selectivo de la GvHD (21-23). El éxito de la terapia con células T y la terapia génica con células T depende de la capacidad de las células T para proliferar y sobrevivir a largo plazo in vivo. Para alcanzar esta meta, las células T necesitan asentarse adecuadamente en órganos linfoides secundarios, donde ocurre el encuentro apropiado con el antígeno e induce las células T a adquirir funciones efectoras. Está siendo cada vez más reconocido que estos atributos tienden a segregarse en etapas precoces de la... [Seguir leyendo]

1.- Un método in vitro para obtener una población de células T de memoria modificadas genéticamente, que se caracteriza por comprender los pasos de: a) activar linfocitos con al menos dos anticuerpos agonistas de receptores de activación específicos en donde uno de los anticuerpos agonistas de receptores de activación de linfocitos es específico para el polipéptido CD3 y el otro anticuerpo agonista de los receptores de activación de linfocitos es específico para el anticuerpo CD28; b) exponer los linfocitos activados a una cantidad eficaz de al menos IL-7 e IL-15, capaz de expandir selectivamente poblaciones de células T de memoria; c) insertar y expresar un gen exógeno por medio de un vector apropiado en las células obtenidas en b). 2.- El método in vitro de la reivindicación 1 en donde dichas poblaciones de células T de memoria comprenden poblaciones de células T CD4 + y/o CD8 + y/o y8 y/o NKT. 3.- El método in vitro de las reivindicaciones 1 ó 2 que se caracteriza porque en el mismo dichos linfocitos se derivan de una muestra biológica perteneciente al grupo de: muestras de sangre y otros líquidos de origen biológico, muestras de tejido sólido, cultivos tisulares de células derivadas de los mismos y la progenie de los mismos, células aisladas de muestras biológicas. 4.- El método in vitro de las reivindicaciones 1 a 3 que se caracteriza porque en el mismo el agonista receptor de activación de los linfocitos específico está conjugado con soportes que mimetizan células. 5.- El método in vitro de las reivindicaciones 1 a 4 que se caracteriza porque en el mismo los soportes que mimetizan células son cuentas paramagnéticas. 6.- El método in vitro de las reivindicaciones 1 a 5 que se caracteriza porque en el mismo el vector es un vector viral. 7.- El método in vitro de las reivindicaciones 1 a 6 que se caracteriza porque en el mismo el gen exógeno codifica un gen suicida, y/o un gen marcador, y/o una molécula biológicamente activa, y/o un receptor, y/o un factor soluble retenido en la célula o liberado al exterior de la célula y/o un gen que confiere resistencia a un profármaco.   Multiplicidad de expansión el día 14 Eficiencia de transducción de RV (%) 16 Ratio CD4/CD8   Distribución relativa (% de células CD4 + ) Distribución relativa (% de células CD4 + ) Distribución relativa (% de células CD8 + ) Distribución relativa (% de células CD8 + ) 17   Distribución relativa (% de células CD4 + ) Distribución relativa (% de células CD4 + ) 18   Eficiencia de transducción (%) Ratio CD4/8 Expansión celular Día 6 Día 9 19   % de células/células transducidas Naíf (CD45RA + CD62L + ) Memoria central (CD45RA - CD62L + ) Memoria efectora (CD45RA - CD62L - ) Efectores (CD45RA + CD62L - )   % de células CD8 positivas % de células CD4 positivas Días después de la estimulación inicial 21   % de células CD8 positivas % de células CD4 positivas Días después de la estimulación inicial 22   % de células CD8 positivas % de células CD4 positivas Días después de la estimulación inicial 23   Recuento de células muertas % de células en división (x 10 6 /ml) 24   recuento   Células T humanas 26 semana   Pérdida de peso corporal Registro de GvHD Días después de la infusión de células T Días después de la infusión de células T 27   28   Referencias citadas en la descripción Esta lista de referencias citadas por el solicitante es para comodidad del lector únicamente. No forma parte del documento de la patente europea. Aun cuando se tuvo gran cuidado al reunir las referencias, no se pueden excluir errores u omisiones y la Oficina Europea de Patentes (EPO) declina toda responsabilidad a este respecto. Los documentos de patente citados en la descripción US 20050074822 A [0003] Literatura no de patentes citada en la descripción Jenkins, M.K.; A. Khoruts; E. Ingulli; D.L. Mueller; S.J. Mc Sorley; R.L: Reinhardt; A.Irano; K.A. Pape. In vivo activation of antigen-secific CD4 T cells. Annu Rev Immunol, 2001, vol.19, 23-45 [0065] Sprent, J.; C.D. Surh. T cell memory. Annu Rev Immunol, 2002, vol. 20, 551-579 [0065] Marrack, P.; J. Bender; D. Hildeman; M. Jordan; T.Mitchell; M. Murakami; A. Sakamoto; B.C. Schaefer; B. Swanson; J. Kappler. Homeostasis of alpha beta TCR+ T cells . Nat Immunol, 2000, vol. 1, 107-111 [0065] Novak, E.J.; A.W. Liu; G.T. Nepom; W.W. Kwok. 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