Un método para procesar un fluido biológico para la determinación de un analito.

Un método para procesar un fluido biológico que comprende eritrocitos,

en el que el fluido se somete a un tratamientotérmico que se lleva a cabo una temperatura de 60-90ºC y durante un tiempo de 5 segundos a 1 minuto encondiciones

(i) para proporcionar una disgregación sustancialmente cuantitativa de dichos eritrocitos, y

(ii) para no provocar sedimentación, precipitación, desnaturalización, aglutinamiento y gelificación sustanciales delos componentes del fluido.

Un método para procesar un fluido biológico para la determinación de un analito

La presente invención se refiere a un método para procesar un fluido biológico que comprende eritrocitos mediante tratamiento térmico. El método es particularmente útil para preparar muestras biológicas para la detección de anali5 tos. Adicionalmente, la invención se refiere a un fluido biológico procesado, que comprende componentes celulares disgregados sustancial y cuantitativamente.

La determinación de analitos en muestras procedentes de fluidos biológicos requiere a menudo procedimientos de pretratamiento complicados y tediosos a fin de eliminar componentes celulares de la muestra fluida. Por ejemplo, la sangre completa contiene componentes, a saber, eritrocitos, leucocitos y trombocitos. A fin de determinar analitos en 10 una muestra de sangre, estos componentes celulares a menudo tienen que ser eliminados mediante procedimientos de pretratamiento tales como centrifugación, filtración, sedimentación y/u homogeneizados mediante lisis usando reactivos químicos o tratamiento mecánico. Sin embargo, estos procedimientos a menudo son difíciles de integrar en un formato de ensayo automatizado. Esto también es aplicable para una situación en la que los analitos diana están presentes en los componentes celulares, por ejemplo fármacos inmunosupresores en eritrocitos. En este caso, los

componentes celulares se aíslan o se enriquecen mediante centrifugación y/o filtración antes de la adición de un reactivo de lisis, o se desnaturalizan mediante adición de un agente desnaturalizante a la muestra original, por ejemplo una mezcla de ZnSO4 y acetonitrilo, o la muestra original se trata con temperaturas de -20 a -170ºC.

Un objeto de la presente invención fue proporcionar un método mejorado para procesar fluidos biológicos, que no tenga las desventajas asociadas con procedimientos de la técnica anterior.

Un primer aspecto de la presente invención es un método para procesar un fluido biológico que comprende eritrocitos, como se define en la reivindicación 1.

Un aspecto adicional de la presente invención es un fluido biológico procesado que comprende eritrocitos cuantitativamente disgregados, que está libre de productos de sedimentación, precipitación, desnaturalización, aglutinamiento y gelificación, como se define en la reivindicación 8.

Aún un aspecto adicional de la presente invención es un método para determinar un analito en una muestra de fluido biológico, en el que el fluido biológico se procesa como se describe anteriormente, y el analito se determina en el fluido biológico procesado.

Sorprendentemente, se ha encontrado que se puede lograr una digregación completa de componentes celulares, preferiblemente células o agrupamientos de células de organismos superiores, más preferiblemente células de ani

males tales como células de mamífero, incluyendo células de seres humanos, y lo más preferible células de la sangre tales como eritrocitos, leucocitos y/o trombocitos, en muestras de sangre, mediante tratamiento térmico en condiciones predeterminadas de tiempo y temperatura. Por medio de este tratamiento térmico, los componentes celulares contenidos en un fluido biológico se disgregan sin sedimentación, precipitación, desnaturalización, aglutinamiento y/o gelificación sustancial de los componentes del fluido.

El tratamiento térmico se puede llevar a cabo a una temperatura de 60-90ºC, preferiblemente de 60-75ºC, y más preferiblemente de 65-70ºC. El tratamiento térmico se lleva a cabo durante un tiempo suficiente para lograr una disgregación deseada a la temperatura de tratamiento escogida. Preferiblemente, el tratamiento térmico se lleva a cabo durante un tiempo de 5 segundos a 1 minuto, más preferiblemente de 10 segundos a 40 segundos. Se prefiere especialmente una temperatura de 70ºC durante 30-40, por ejemplo 35 segundos. El tratamiento térmico se puede

llevar a cabo en cualquier recipiente adecuado, por ejemplo un capilar de vidrio (55 x 0, 5 mm de diámetro interno) .

En la Tabla 1 se muestran condiciones adecuadas para el tratamiento térmico de una muestra de sangre completa con un recuento eritrocítico dado, opcionalmente suplementada con disolventes orgánicos y/o plasma del grupo sanguíneo AB. Estas condiciones de temperatura/tiempo se definen mediante un límite de tiempo superior (indicado como valor tmax) a una temperatura dada, y mediante un límite de tiempo inferior (indicado como valor tmin) a una

45 temperatura dada. Si el tratamiento térmico se lleva a cabo durante un período de tiempo más prolongado que el valor tmax, se produce gelificación. Si el período del tratamiento térmico es más corto que el valor tmin, solamente se produce la disgregación incompleta. Si se añaden otros fluidos, por ejemplo disolventes orgánicos y/o fluidos acuosos, por ejemplo plasma, a la muestra antes del tratamiento térmico, los valores de tmax y tmin pueden variar como se muestra en las Tablas 2-6.

50 La gelificación de la muestra se puede determinar por un incremento de la viscosidad. La terminación de la disgregación se puede determinar mediante el recuento de células, por ejemplo en una cámara de recuento de Neubauer, mediante inspección microscópica para componentes particulares y/o mediante la falta de formación de sedimentos tras la centrifugación. En este contexto, se debería de señalar que alrededor de 95% de los componentes celulares de la sangre están representados por eritrocitos. De este modo, el recuento celular en una muestra de sangre se

55 determina preferiblemente contando los eritrocitos.

Por medio de la presente invención, el recuento celular en la muestra se reduce preferiblemente hasta 0, 1% o menos, y más preferiblemente hasta 0, 01% o menos del valor original. Por ejemplo, cuando se somete una muestra con 5 x 106 eritrocitos por !l a tratamiento térmico, el recuento celular se reduce preferiblemente hasta 5 x 103 células o menos por !l (véase el Ejemplo 1) , más preferiblemente hasta 500 células o menos por !l. Lo más preferible, la muestra está libre de células detectables. La ausencia de componentes particulares también se puede determinar

mediante observación microscópica a la luz, por ejemplo con un aumento de hasta 100x, y/o mediante centrifugación durante 10 minutos a una velocidad de hasta 3000g, preferiblemente hasta 7400g.

El tratamiento térmico se puede llevar a cabo cuando el fluido se mantiene estático, por ejemplo mientras que el fluido está en una vasija de reacción. En una realización preferida, sin embargo, particularmente para operaciones automatizadas, el tratamiento térmico se puede llevar a cabo mientras que el fluido está en circulación, por ejemplo 10 mientras que el fluido se hace pasar a través de un conducto. El tratamiento térmico en un sistema que fluye se puede llevar a cabo mientras se hace pasar el fluido de la muestra a través de un conducto calentado, por ejemplo un conducto capilar, preferiblemente con un diámetro interno de alrededor de 0, 1-0, 8 mm, por ejemplo de alrededor de 0, 5 mm, con un caudal predeterminado, en el que el conducto tiene una longitud predeterminada a fin de lograr el tiempo de permanencia deseado dentro del conducto calentado. El calentamiento se puede llevar a cabo por cual

quier medio adecuado, y puede comprender, por ejemplo, calentamiento inductivo, tal como tratamiento con microondas, por ejemplo como se describe en el documento US 6.605.454, calentamiento convectivo, calentamiento resistivo y/o calentamiento mediante excitación con láser.

El fluido biológico puede ser un fluido biológico tal como sangre completa, tal como sangre venosa, arterial o capilar, particularmente sangre completa tratada con anticoagulantes, por ejemplo sangre completa tratada con EDTA, citra

to, o heparina. Por ejemplo, se puede tomar una muestra con un dispositivo de extracción de sangre que contiene un anticoagulante, y se puede someter directamente a un procesamiento posterior como se describe más abajo.

El volumen de la muestra puede variar ampliamente, por ejemplo en el intervalo de 1 nl o más, preferiblemente 10 nl

o más, y hasta 1 ml. De este modo, el método es adecuado para aplicaciones en miniatura, por ejemplo dispositivos microfluídicos en formato de chip, análisis nano LC-MS, etc.

El método de la presente invención... [Seguir leyendo]

1. Un método para procesar un fluido biológico que comprende eritrocitos, en el que el fluido se somete a un tratamiento térmico que se lleva a cabo una temperatura d.

6. 90ºC y durante un tiempo de 5 segundos a 1 minuto en condiciones

(i) para proporcionar una disgregación sustancialmente cuantitativa de dichos eritrocitos, y

(ii) para no provocar sedimentación, precipitación, desnaturalización, aglutinamiento y gelificación sustanciales de los componentes del fluido.

2. El método de la reivindicación 1, en el que el tratamiento térmico se lleva a cabo a una temperatura d.

6. 75ºC.

3. El método de la reivindicación 1 ó 2, en el que el tratamiento térmico se lleva a cabo durante un tiempo de 5 se10 gundos a 40 segundos.

4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en el que el fluido biológico es un fluido corporal.

5. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que no incluye

(i) una etapa de sedimentación ni/o una etapa de precipitación, ni/o una etapa de centrifugación, ni/o

(ii) una adición de reactivos de disgregación química y/o de lisis.

15 6. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que antes y/o después del procesamiento se añade un fluido adicional, en el que el fluido adicional es un disolvente orgánico en una cantidad de hasta 20% (vol/vol) basada en el volumen del fluido biológico, tal como metanol, etanol, acetonitrilo y/o dimetilsulfóxido.

7. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que se lleva a cabo como un procedimiento automatizado, preferiblemente en un dispositivo integrado.

20 8. Un fluido biológico procesado que comprende eritrocitos obtenibles mediante el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, que comprende eritrocitos sustancial y cuantitativamente disgregados que está libre de productos de sedimentación, precipitación, desnaturalización, aglutinamiento y gelificación, y que

(i) está libre de componentes particulares al observarlo al microscopio (por ejemplo, un aumento de 100 x) ;

(ii) está libre de sedimento tras la centrifugación durante 10 min. a una velocidad de 3000g, preferiblemente hasta 25 7400g, y/o

(iii) está libre de células según se determina en una cámara de recuento celular,

en el que dicho método no incluye una etapa de sedimentación ni/o una etapa de precipitación ni/o una etapa de centrifugación.

9. El fluido procesado de la reivindicación 8, que tiene una concentración salina sustancialmente fisiológica.

10. El fluido procesado de una cualquiera de las reivindicaciones 8 ó 9, que está libre de reactivos añadidos, particularmente reactivos de disgregación y/o de detergentes.

11. Un método para determinar un analito en una muestra de fluido biológico que comprende eritrocitos, en el que el fluido biológico se procesa según el método de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, y el analito se determina en el fluido biológico procesado.

12. El método la reivindicación 11, en el que el analito se selecciona de compuestos biológicos tales como ácidos nucleicos, polipéptidos, péptidos, lípidos, azúcares, hormonas, metabolitos, compuestos farmacéuticos, preferiblemente fármacos inmunosupresores, tales como ciclosporina, rapamicina o tacrolimus.

13. El método de la reivindicación 11 ó 12, en el que la determinación comprende una reacción de hibridación, una

reacción inmunológica, una reacción enzimática, un análisis cromatográfico, un análisis espectrométrico y/o un aná40 lisis espectroscópico.

14. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 12-13, en el que la muestra se procesa y se determina en un dispositivo integrado.