Un receptor nativo maduro aislado de factor inductor de la proteólisis (PIF),

caracterizado porque el extremo N del receptor nativo maduro tiene la secuencia aminoacídica:

o:

en el que dicho receptor:

(a) es obtenible mediante un proceso que comprende:

(i) solubilizar membranas de miotúbulos de murino mediante incubación con PIF radiomarcado en Triton al 1 %;

(ii) purificar el receptor de PIF en una columna de aglutinina de germen de trigo-agarosa capaz de unirse a PIF, y

(iii) eluir el receptor libre con N-acetilglucosamina 0, 1 M, teniendo dicho receptor una Mr de aproximadamente 40.000, usando PAGE-SDS al 15 % y cromatografía de exclusión en Sephadex G-50, y/o

(b) comprende adicionalmente al menos una, dos o todas las secuencias aminoacídicas internas seleccionadas de la lista consistente en:

Tratamiento de caquexia.

La presente invención se refiere al tratamiento de caquexia.

Muchos pacientes (aproximadamente un 50 %) de cáncer padecen un grave agotamiento de su masa corporal magra así como tejido adiposo, que se ha ligado con un tiempo de supervivencia reducido. Perder hasta un 30 % de peso corporal puede provocar la muerte y dicho agotamiento de la masa muscular puede dar cuenta de más de un 20 % de las muertes de pacientes de cáncer. Esta afección forma parte de un síndrome metabólico complejo conocido como caquexia por cáncer, en que es evidente la pérdida de proteína del músculo esquelético, pero los órganos viscerales tales como hígado y riñón están relativamente intactos, diferenciándose así esta afección de la inanición simple. Aunque se han asociado una serie de citocinas, incluyendo factor de necrosis tumoral a (TNF-a) , interleucina 6 (IL-6) y factor neurotrófico ciliar (CNTF) , con el agotamiento de proteína en la caquexia, pocos estudios han reseñado un efecto directo sobre el proceso degradativo.

Los inventores han aislado anteriormente, tanto de tumor de murino inductor de caquexia como de orina de pacientes de cáncer con caquexia, un factor tumoral capaz de inducir la pérdida de peso en ratones normales, con agotamiento específico de la masa esquelética no grasa (Todorov, P., Cariuk, P., McDevitt, T., Coles, B., Fearon, K. y Tisdale, M. "Characterization of a cancer cachectic factor". Nature, 379: 739-742, 1996) . Se dio cuenta de la pérdida de proteína corporal por un aumento de la degradación proteica y una reducción de la síntesis de proteína en músculo esquelético. Este material, que han llamado factor inductor de la proteólisis (PIF) , es también capaz de inducir la degradación proteica en músculo gastrocnemio aislado. El efecto del PIF sobre los pesos de órganos en ratones normales era similar al observado en caquexia, con una reducción del peso de los músculos sóleo y gastrocnemio, ningún cambio en el peso de corazón o riñón y un aumento en el peso del hígado.

El PIF es una glucoproteína sulfatada de Mr 24.000 que contiene cadenas oligosacáridas ligadas tanto por N como por O, que han mostrado ser esenciales para la actividad biológica (Todorov, P.T., Deacon, M. y Tisdale,

M.J. "Structural analysis of a tumor-produced sulfated glycoprotein capable of initiating muscle protein degradation".

J. Biol. Chem., 272: 12279-12288, 1997) . Tanto el PIF de ratón como de humano parecen contener componentes carbohidratos idénticos, como se define por su reactividad con un anticuerpo monoclonal de murino dirigido hacia los residuos oligosacáridos. Además, el análisis de secuencia aminoacídica de los residuos N-terminales mostró homología entre las dos especies (Cariuk, P., Lorite, M.J., Todorov, P.T., Field, W.N., Wigmore, S.J. y Tisdale, M.J. "Induction of cachexia in mice by a product isolated from the urine of cachectic cancer patients". Br. J. Cancer, 76: 606-613, 1997) , sugiriendo que la degradación proteica en caquexia por cáncer puede ser idéntica en ratón y ser humano.

Para que el PIF ejerza un efecto catabólico sobre el músculo esquelético, los inventores creen que debe haber receptores de superficie celular específicos capaces de transmitir una respuesta biológica a la maquinaria de degradación proteica intracelular.

Es un objetivo de la presente invención proporcionar un receptor de alta afinidad por PIF, proporcionar agentes que sean eficaces para modular la caquexia mediante interacción con dichos receptores y proporcionar también un cribado para identificar dichos agentes.

Según un primer aspecto de la presente invención, se proporciona un receptor aislado para el factor inductor de la proteólisis (PIF) caracterizado porque el extremo N del receptor nativo maduro tiene la secuencia aminoacídica:

y derivados funcionales de los mismos.

La presente invención está basada en la investigación realizada por los inventores que investigaron la actividad de unión de PIF. Estos experimentos se describen con más detalle en los ejemplos adjuntos. Brevemente, los inventores han aislado el receptor a partir de membranas solubilizadas (con 1 % de Triton) de miotúbulos de murino mediante incubación con PIF radiomarcado. Se purificó el complejo PIF-receptor en una columna de aglutinina de germen de trigo-agarosa, que podía unirse a PIF, y se eluyó el receptor libre con N-acetilglucosamina 0, 1 M. Se encontró que el receptor era una única proteína de Mr aproximadamente 40.000 usando PAGE-SDS al 15 % y cromatografía de exclusión con Sephadex G-50.

Los inventores efectuaron una digestión tríptica seguida de un análisis de secuencia (Edman) del receptor de PIF y establecieron que el extremo N del receptor maduro empezaba con la secuencia aminoacídica de SEQ ID No. 1. Esta secuencia tiene homología con un fragmento peptídico de la proteína de fluido sinovial p205, con actividad estimulante de linfocitos T (J. Immunol.; (1996) 157; 1773-80) . Se obtuvo una secuencia N-terminal adicional que se cree que puede ser una forma polimórfica (SEQ ID No. 13) . Esta secuencia difiere en 5 aminoácidos de la SEQ ID No. 1 y es más básica que la SEQ ID No. 1. Aun sin desear ligarse a mecanismo alguno, puesto que el PIF es ácido, se cree que un receptor que comprenda la SEQ ID No. 13 puede interaccionar más fuertemente con él.

Los análisis adicionales del receptor que comprende la SEQ ID No. 1 identificaron fragmentos peptídicos internos con las siguientes secuencias aminoacídicas:

Los inventores no pudieron localizar ninguna homología de secuencia de estos péptidos internos con otras proteínas en bases de datos públicas. Por consiguiente, el receptor de PIF según la presente invención 25 representa una proteína novedosa.

Se prefiere que el receptor de PIF según el primer aspecto de la invención comprenda adicionalmente al menos una secuencia peptídica interna de SEQ ID No. 2-10. Más preferiblemente, el receptor comprende adicionalmente al menos dos de dichos péptidos internos y lo más preferiblemente el receptor comprende cada uno de los péptidos internos.

Los derivados funcionales preferidos del receptor de PIF incluyen proteínas que pueden comprender mutaciones (respecto al tipo silvestre) que no obstante no alteran la actividad del receptor. Según la presente invención, los cambios adicionales preferidos en el receptor son conocidos comúnmente como sustituciones 35 "conservativas" o "seguras". Las sustituciones aminoacídicas conservativas son aquellas por aminoácidos que tengan propiedades químicas suficientemente similares, para conservar la estructura y función biológica del receptor. Es evidente que pueden realizarse también inserciones y deleciones de aminoácidos en las secuencias anteriormente definidas sin alterar su función, particularmente si las inserciones o deleciones implican solo unos pocos aminoácidos, por ejemplo, menos de 10 y preferiblemente menos de 5, y no eliminan ni desplazan aminoácidos que sean críticos para la conformación funcional del receptor. La bibliografía proporciona muchos modelos en los que puede efectuarse la selección de sustituciones aminoacídicas conservativas basándose en los estudios estadísticos y fisicoquímicos sobre la secuencia y/o estructura de una proteína natural.

Según un segundo aspecto de la presente invención, se proporciona un ácido nucleico que codifica el 45 receptor según el primer aspecto de la invención.

El ácido nucleico puede ser una molécula de ADN o una molécula de ARN (por ejemplo ARNm) .

Preferiblemente, el ácido nucleico tiene una secuencia nucleotídica sustancialmente como se indica en la SEQ ID No. 11 (secuencia predicha para el fragmento N-terminal humano de SEQ ID No. 1 basándose en el uso de codón más común) o un derivado o variante funcional del mismo.

Como alternativa, el ácido nucleico tiene una secuencia nucleotídica sustancialmente como se indica en la SEQ ID No. 14 (secuencia predicha para el fragmento N-terminal humano de SEQ ID No. 13 basándose en el uso de codón más común) o un derivado o variante funcional del mismo.

El ácido nucleico puede estar contenido en un vector adecuado para formar un vector recombinante. Por tanto, según un tercer aspecto de la invención, se proporciona un vector que comprende un ácido nucleico según el segundo aspecto. El vector puede ser, por ejemplo, un plásmido, cósmido o fago. Dichos vectores recombinantes son altamente útiles... [Seguir leyendo]

1. Un receptor nativo maduro aislado de factor inductor de la proteólisis (PIF) , caracterizado porque el extremo N del receptor nativo maduro tiene la secuencia aminoacídica:

o:

en el que dicho receptor:

(a) es obtenible mediante un proceso que comprende: 15

(i) solubilizar membranas de miotúbulos de murino mediante incubación con PIF radiomarcado en Triton al 1 %;

(ii) purificar el receptor de PIF en una columna de aglutinina de germen de trigo-agarosa capaz de

unirse a PIF, y 20 (iii) eluir el receptor libre con N-acetilglucosamina 0, 1 M, teniendo dicho receptor una Mr de aproximadamente 40.000, usando PAGE-SDS al 15 % y cromatografía de exclusión en Sephadex G-50, y/o (b) comprende adicionalmente al menos una, dos o todas las secuencias aminoacídicas internas seleccionadas de la 25 lista consistente en:

2. Un proceso para producir un receptor mutado del factor inductor de la proteólisis (PIF) , siendo dicho receptor un derivado funcional de un receptor según la reivindicación 1, comprendiendo el proceso introducir mutaciones en el receptor según la reivindicación 1 que retiene su actividad de receptor de PIF.

3. Un ácido nucleico que codifica un receptor según la reivindicación 1.

4. Un ácido nucleico según la reivindicación 3 que tiene una secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID No. 11:

o que tiene una secuencia nucleotídica como se expone en la SEQ ID No. 14:

5. Un vector que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, y que opcionalmente incluye uno o más de: elementos que inducen la replicación de ADN; elementos que favorecen la integración orientada en el genoma de una célula; un marcador seleccionable; un promotor.

6. Un anticuerpo capaz de unirse específicamente con un receptor según la reivindicación 1.

7. Un anticuerpo según la reivindicación 6 que (a) bloquea la señalización intracelular mediada por receptor y/o (b) se ha creado contra uno cualquiera de los péptidos de SEQ ID No. 1-10 o 13; y/o (c) es policlonal o monoclonal; y/o (d) es una y-inmunoglobulina (IgG) .

8. Un derivado funcional de un anticuerpo según la reivindicación 6 o la reivindicación 7, que tiene al

menos el dominio variable del mismo, que es opcionalmente un fragmento de anticuerpo y que es opcionalmente un anticuerpo scFV, siendo capaz dicho derivado de unirse específicamente con un receptor según la reivindicación 1.

9. Un anticuerpo según la reivindicación 6 o la reivindicación 7, que es un anticuerpo humanizado.

10. Un agente que reduce la actividad biológica de un receptor según la reivindicación 1 para uso como medicamento para el tratamiento de caquexia, en el que el agente reduce opcionalmente la actividad biológica del receptor:

(a) reduciendo la expresión del receptor de PIF; 25

(b) aumentando la desensibilización del receptor o la degradación del receptor;

(c) reduciendo la interacción entre el PIF y el receptor que es su receptor endógeno;

(d) reduciendo la señalización intracelular mediada por el receptor de PIF;

(e) compite con el receptor endógeno por la unión de PIF;

(f) uniéndose al receptor para bloquear la unión de PIF; o 35

(g) uniéndose al PIF para evitar la interacción con el receptor.

en el que el agente se selecciona de la lista consistente en: (a) un anticuerpo o derivado funcional según una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, o (b) un receptor de la reivindicación 1 o un fragmento del mismo, o (c) un fragmento N-terminal del receptor, opcionalmente seleccionado de, o que comprende, las SEQ ID NO. 1 o SEQ ID NO. 13, y que es opcionalmente un derivado peptídico que tiene una semivida in vivo aumentada en comparación con el fragmento de receptor del que derivaba, o (d) una molécula de ADN o ARN anticodificante que se unirá a transcritos de ARN del receptor endógeno para reducir la expresión de receptor, que es opcionalmente una molécula anticodificante seleccionada de:

(e) una molécula de ARNip o ARNhc que comprende una molécula de ARN anticodificante que se unirá a transcritos de ARN del receptor endógeno para reducir la expresión del receptor.

11. Un procedimiento de cribado de un compuesto para ensayar si el compuesto tiene eficacia o no para tratar caquexia, que comprende:

(i) exponer células o membranas que comprenden un receptor según la reivindicación 1 a un compuesto de ensayo durante un periodo de tiempo predeterminado;

(ii) detectar la actividad o expresión del receptor; y

(iii) comparar la actividad o expresión del receptor en las células o membranas tratadas con el compuesto respecto a la actividad o expresión encontrada en células o membranas de control que no se trataron con el compuesto;

en el que los compuestos con eficacia para tratar caquexia reducen la actividad o reducen la expresión del receptor respecto a los controles.

12. Un procedimiento de cribado de un compuesto para ensayar si el compuesto causa o no caquexia, que comprende:

(i) exponer células o membranas que comprenden un receptor según la reivindicación 1 a un compuesto de ensayo durante un periodo de tiempo predeterminado;

(ii) detectar la actividad o expresión del receptor; y

(iii) comparar la actividad o expresión del receptor en las células o membranas tratadas con el compuesto respecto a la actividad o expresión encontrada en células o membranas de control que no se trataron con el compuesto;

en el que los compuestos que causan caquexia aumentan la actividad o aumentan la expresión del receptor respecto a los controles.

13. Un procedimiento según la reivindicación 11 o la reivindicación 12 (a) que es un procedimiento in vivo en que las células presentes en cualquier animal experimental se exponen al compuesto de ensayo y/o (b) en que las células se transforman con un vector según la reivindicación 5 para expresar dicho receptor en dichas células; y/o (c) en el que el nivel de expresión en las células o membranas se evalúa usando un anticuerpo marcado que es un anticuerpo según la reivindicación 6, un ligando PIF radiomarcado o un compuesto de ensayo radiomarcado.

14. Uso de un agente que reduce la actividad biológica del receptor según la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de caquexia, en el que el agente es según la reivindicación 10.