Biblioteca de oligonucleótidos que codifican péptidos aleatorizados.

Un kit para producir una biblioteca de oligonucleótidos, comprendiendo la librería una pluralidad deoligonucleótidos,

presentando cada oligonucleótido al menos dos posiciones predeterminadas, un codón dealeatorización seleccionado de un grupo definido de codones, codificando los codones de dicho grupo definidopara diferentes aminoácidos, y donde cada oligonucleótidos de la biblioteca tiene al menos dos codones dealeatorización contiguos; el kit comprende una pluralidad de diferentes oligonucleótidos de aleatorización dedoble cadena que comprenden:

(i) una cadena codificadora, comprendiendo la cadena codificadora un codón de aleatorización; y

(ii) una cadena no codificadora sustancialmente complementaria,

donde cada oligonucleótido de aleatorización de cadena doble comprende una secuencia de nucleótidos quecodifica para un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción capaz de ser reconocido por unaendonucleasa de restricción, siendo la endonucleasa de restricción capaz de escindir el oligonucleótido dealeatorización secuencia arriba o secuencia abajo del sitio de reconocimiento de endonucleasa en un sitio deescisión predeterminado para crear un corte de extremo romo; y donde el sitio de escisión de la endonucleasapredeterminado es adyacente al codón de aleatorización.

Biblioteca de oligonucleótidos que codifican péptidos aleatorizados

La invención se refiere a la producción de bibliotecas de oligonucleótidos que codifican péptidos aleatorizados, a vectores y células huésped que contienen dichas bibliotecas y a kits para la producción de dichas bibliotecas.

Las técnicas combinatoriales para la producción de péptidos han estados disponibles desde la década de los años sesenta y han incluido la síntesis de péptidos en fase sólida y, adicionalmente, los procedimientos paralelos de síntesis en fase sólida desarrollados en los años ochenta. Estas técnicas se revisan en el artículo de Pinilla C., y col. (Nature Medicine (2003) , Vol. 9, páginas 118 – 122) .

La producción de bibliotecas de ADN que codifican diferentes péptidos es bien conocida per se en la materia. Las bibliotecas de genes aleatorizados tienen poco en común con la genómica convencional o con las bibliotecas de ADNc. Las bibliotecas convencionales consisten en clones que cubren colectivamente un genoma / transcriptoma completo y, generalmente, se seleccionan mediante hibridación de ácidos nucleicos. Por el contrario, las bibliotecas aleatorizadas generalmente contienen variaciones de un gen o de un fragmento de un gen que se seleccionan por su actividad novedosa. Los genes aleatorizados se expresan y seleccionan de forma convencional, por ejemplo, en fagos, bacterias o en técnicas de despliegue in vitro.

Convencionalmente, las técnicas de aleatorización de genes convencionales obligan a la clonación de un exceso de genes usando los codones NNN o NN G/T donde N = A, C, G y T, y tienen que clonarse 64 o 32 codones, respectivamente, para asegurarse la representación de los 20 aminoácidos. En un principio, estos datos pueden parecer relativamente pequeños, pero si consideramos posiciones múltiples de aleatorización, existe una relación exponencial entre el número de genes clonados y el número de proteínas obtenidas. Hine y col. han descrito previamente un procedimiento alternativo para producir bibliotecas de ADN, la aleatorización "MAX", en la que se aleatorizan dos o más posiciones de modo que están representados los 20 aminoácidos, o un subgrupo de los mismos (publicación de PCT WO 00/15777) . Esta metodología requiere un conjunto de oligonucleótidos para cada posición que se va a aleatorizar, que hibrida con un molde, convencionalmente (NNN) , aleatorizado en las posiciones apropiadas. Esta aproximación permite que cada aminoácido esté codificado sólo una vez dentro de los conjuntos de oligonucleótidos, por tanto, el número de genes únicos generados es equivalente al número de proteínas codificadas, independientemente del número de posiciones de aleatorización. Aunque esta metodología representa una mejora significativa con respecto a las técnicas tradicionales, sigue habiendo un porcentaje relativamente alto de codones no-MAX (no deseados) (~ 10 %) en las posiciones aleatorizadas. Adicionalmente, debido a las limitaciones del proceso de hibridación sólo se producen pequeñas cantidades de las construcciones de ADN, las cuales son difíciles de manipular especialmente cuando codifican subconjuntos de aminoácidos.

Posteriormente, Hine y col. han hecho mejoras en esta metodología que eliminan prácticamente la presencia de secuencias no deseadas y mejoran el rendimiento de ADN (Hine, A.V., Hughes, M.D., Nagel, D.A., Ashraf, M. y Santos, A.F. (2002) . MAX Codon Gene Libraries. Documento WO 03/106679; Hughes M.D., Nagel D.A., Santos A.F., Sutherland A.J. y Hine A.V. (2003) . Removing the redundancy from randomised gene libraries. J. Mol. Biol. 331 (5) , 973 – 979) . Esta metodología emplea algunos oligonucleótidos adicionales que hibridan con la cadena molde pero que también proporcionan una extensión que no es complementaria a la cadena molde. Esto permite la amplificación selectiva de la cadena codificadora requerida aumentando de este modo el rendimiento y minimizando las secuencias no deseadas.

El problema asociado a los procedimientos previos de la técnica ha sido la producción de más de dos codones aleatorizados contiguos. Esto es importante para permitir extensiones de varios aminoácidos en la secuencia que se va a aleatorizar. Las variaciones de los procedimientos descritos en, por ejemplo, el documento WO 03/106679 sólo permiten aleatorizar dos codones contiguos ya que se requiere el uso de secuencias de oligonucleótidos flanqueantes que hibriden con las cadenas molde. Adicionalmente, estos procedimientos requieren la producción de una cadena molde aleatorizada que se producirá antes de usar los oligonucleótidos de selección. Potencialmente esto limita el número de codones que pueden aleatorizarse debido a la complejidad / masa del oligonucleótido molde.

Los inventores probaron diversas técnicas en las que se aleatorizaban tres o más oligonucleótidos consecutivos, lo que demostraba que era difícil obtener, o alternativamente producir, unos resultados satisfactorios. Entre estos se incluye intentar ligar aleatoriamente tres o más trinucleótidos MAX en un oligonucleótido de cadena sencilla usando la ARN ligasa. Se comprobó que esta última técnica proporcionaba un resultado muy pobre y la posterior amplificación por PCR producía una mancha de la que los inventores no podían aislar muestras individuales. También se ha comprobado que es difícil la adición de codones MAX, que contienen 3 nucleótidos, ligados directamente al extremo romo de un oligonucleótido.

La técnica identificada ahora y descrita por los inventores permite inesperadamente la producción de codones aleatorizados contiguos sin la necesidad de producir oligonucleótidos molde aleatorizados.

Se describe un procedimiento para producir una biblioteca de oligonucleótidos que comprende una pluralidad de oligonucleótidos, presentando cada oligonucleótido de la biblioteca al menos una posición predeterminada, un codón de aleatorización seleccionado de un grupo definido de codones, codificando los codones de dicho grupo definido para diferentes aminoácidos. Dicho procedimiento comprende las siguientes etapas:

(a) proporcionar uno o más oligonucleótidos iniciadores de cadena doble;

(b) proporcionar una pluralidad de diferentes oligonucleótidos de aleatorización y de cadena doble que comprenden:

(i) una cadena codificadora, comprendiendo la cadena codificadora un codón de aleatorización; y

(ii) una cadena no codificadora sustancialmente complementaria,

en donde cada oligonucleótido de aleatorización de cadena doble comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción capaz de ser reconocido por una endonucleasa de restricción, siendo la endonucleasa de restricción capaz de escindir el oligonucleótido de aleatorización secuencia arriba o debajo del sitio de reconocimiento de la endonucleasa en un sitio de escisión predeterminado para crear un corte de extremo romo;

(c) ligar cada oligonucleótido iniciador de doble cadena a un oligonucleótido de aleatorización de doble cadena para formar oligonucleótidos ligados;

(d) amplificar los oligonucleótidos ligados;

(e) digerir el oligonucleótido ligado con la endonucleasa de restricción para formar una pluralidad de oligonucleótidos aleatorizados de doble cadena, cada uno de los cuales comprende, en un extremo, un codón de aleatorización (y su secuencia complementaria) ; y, opcionalmente,

(f) usar los oligonucleótidos aleatorizados de doble cadena como oligonucleótidos iniciadores y repetir las etapas (a) a la (e) del procedimiento y opcionalmente la etapa (f) para producir una pluralidad de oligonucleótidos aleatorizados de doble cadena, comprendiendo cada uno de ellos un codón de aleatorización adicional.

Los oligonucleótidos aleatorizados difieren porque tienen diferentes codones aleatorizados.

Los oligonucleótidos utilizados son preferentemente de ADN, sin embargo, pueden usarse otros nucleótidos de cadena doble, como ARN o análogos de ADN o ARN.

Preferentemente, los oligonucleótidos iniciadores de cadena doble comprenden un extremo romo al cual se ligan los oligonucleótidos de cadena doble aleatorizados.

El codón de aleatorización de la cadena codificadora y el codón complementario de la cadena no codificadora forman, preferentemente, un extremo... [Seguir leyendo]

1. Un kit para producir una biblioteca de oligonucleótidos, comprendiendo la librería una pluralidad de oligonucleótidos, presentando cada oligonucleótido al menos dos posiciones predeterminadas, un codón de aleatorización seleccionado de un grupo definido de codones, codificando los codones de dicho grupo definido para diferentes aminoácidos, y donde cada oligonucleótidos de la biblioteca tiene al menos dos codones de aleatorización contiguos; el kit comprende una pluralidad de diferentes oligonucleótidos de aleatorización de doble cadena que comprenden:

(i) una cadena codificadora, comprendiendo la cadena codificadora un codón de aleatorización; y

(ii) una cadena no codificadora sustancialmente complementaria,

donde cada oligonucleótido de aleatorización de cadena doble comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción capaz de ser reconocido por una endonucleasa de restricción, siendo la endonucleasa de restricción capaz de escindir el oligonucleótido de aleatorización secuencia arriba o secuencia abajo del sitio de reconocimiento de endonucleasa en un sitio de escisión predeterminado para crear un corte de extremo romo; y donde el sitio de escisión de la endonucleasa predeterminado es adyacente al codón de aleatorización.

2. Un kit según la reivindicación 1, donde el sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción es:

5'-GAGTCNNNNN^-3' (SEC ID Nº 1) 3'-CTCAGNNNNN^-5' (SEC ID Nº 2)

donde

N = cualquier nucleótido ^ = el sitio de escisión de la endonucleasa de restricción.

3. Un kit según la reivindicación 1 o 2 que comprende una enzima de restricción capaz de escindir el oligonucleótido de aleatorización en el sitio de escisión predeterminado.

4. Un kit según la reivindicación 3, donde la endonucleasa de restricción se selecciona de SchI y MlyI.

5. Un kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 donde los codones de aleatorización consisten en codones MAX que representan el uso óptimo de codones de un organismo de interés predeterminado o de una selección predeterminada de dichos codones MAX.

6. Un kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, comprendiendo la cadena codificadora del oligonucleótido de aleatorización de doble cadena un extremo 5' y un extremo 3', comprendiendo el extremo 3' de la cadena codificadora un grupo bloqueante.

7. Un kit según la reivindicación 6, donde el grupo bloqueante se selecciona de un grupo amino, un grupo fosfato, un resto glicerol, un grupo tiol y un resto polietilenglicol.

8. Un kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la cadena no codificadora comprende un extremo 3’ y un extremo 5’, extendiéndose el extremo 5’ de la cadena no codificadora uno o más nucleótidos más allá del extremo 3’ de la cadena complementaria a la codificadora.

9. Un kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, donde la cadena codificadora comprende la secuencia:

(i) 5'XXX^ (N) a R' (N) b -B3' o

(ii) 5'- (N) b R (N) a ^XXX-3'

donde:

XXX es el codón de aleatorización, N es cualquier nucleótido, a es un número entero de 0 a 10, preferentemente 5, b es un número entero de 0 a 40, preferentemente de 1 a 20, o preferentemente de 1 a 10. ^ es el sitio de escisión de la endonucleasa de restricción, R’ es el complemento inverso de la secuencia del sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción, R es la secuencia del sitio de reconocimiento de la endonucleasa de restricción,

B puede o no estar presente y, cuando está presente, puede seleccionarse de -OH, -NH2, fosfato, un resto glicerilo, un tiol y un resto polietilénglicol.

10. Un kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 que comprende adicionalmente un oligonucleótido predefinido que comprende:

(i) una cadena codificadora, comprendiendo la cadena codificadora un codón predefinido que codifica para un aminoácido predefinido; y

(ii) una cadena no codificadora sustancialmente complementaria,

donde el oligonucleótido predefinido comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un sitio de reconocimiento de endonucleasa de restricción capaz de ser reconocido por una endonucleasa de restricción, siendo la endonucleasa de restricción capaz de escindir el oligonucleótido predefinido secuencia arriba o secuencia abajo del sitio de reconocimiento de endonucleasa en un sitio de escisión predeterminado para crear un corte de extremo romo.

11. Un kit según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 que comprende adicionalmente un oligonucleótido de finalización que presenta una secuencia predefinida.

12. Una biblioteca de oligonucleótidos aleatorizados que comprende una pluralidad de oligonucleótidos de doble cadena, teniendo cada oligonucleótido 3 o más codones MAX aleatorizados contiguos que representan el uso óptimo del codón de un organismo predeterminado, y donde los codones MAX son diferentes entre los diferentes miembros de la biblioteca.

13. Una célula huésped que comprende una biblioteca de ADN de la reivindicación 12.