SONDA Y CEBADOR PARA LA DETECCIÓN DE BACILOS TUBERCULOSOS, Y PROCEDIMIENTO PARA LA DETECCIÓN DE BACILOS TUBERCULOSOS HUMANOS CON EL USO DE LOS MISMOS.

Sonda y cebador para la detección de bacilos tuberculosos, y procedimiento para la detección de bacilos tuberculosos humanos con el uso de los mismos Campo técnico La presente invención se refiere a un procedimiento para detectar bacilos tuberculosos humanos, es decir, Mycobacterium tuberculosis (denominados de aquí en adelante Mycobacterium tuberculosis), en pruebas de laboratorio mediante la utilización de una amplificación del ácido nucleico y un sistema de detección de los mismos. Antecedentes de la técnica Mycobacterium tuberculosis es un microbio patógeno que provoca la tuberculosis en seres humanos y es un bacilo Gram positivo perteneciente al género Mycobacterium que tiene propiedades acidófilas. A pesar de la significativa disminución de la tuberculosis en los últimos años, recientemente, se ha convertido en un grave problema debido al aumento de la tasa de incidencia en la tercera edad y al brote de la infección en grupos de jóvenes que no han contraído la infección tuberculosa. Por otro lado, también se sabe que además de Mycobacterium tuberculosis, hay otras micobacterias no tuberculosas, tales como Mycobacterium avium, Mycobacterium intracellulare y Mycobacterium kansasii que también presentan patogenicidad que afecta a los seres humanos. Además, también ha surgido el gran problema de las micobacterias no tuberculosas que desarrollan la enfermedad en pacientes infectados por el virus del SIDA. Como la mayoría de estas micobacteriosis no tuberculosas presentan resistencia contra los agentes antituberculosos, ha cobrado importancia el diagnóstico diferencial entre la micobacteriosis tuberculosa y no tuberculosa para la determinación de la estrategia terapéutica. Sin embargo, como la diferenciación de la tuberculosis en base a las observaciones histopatológicas y de los síntomas clínicos es bastante complicada, el diagnóstico tiene que ser determinado con la identificación de las bacterias. Cuando se realiza el diagnóstico diferencial entre la micobacteriosis tuberculosa y la no tuberculosa, las muestras se cultivan generalmente por separado en el medio de Ogawa, y luego se someten a pruebas bioquímicas para la identificación de las especies. Sin embargo, como el crecimiento del género Mycobacterium es generalmente lento, se requiere un tiempo considerablemente largo de cultivo. Por esa razón, cuando se realizan pruebas fundamentales convencionales, tales como el examen de frotis y el examen de cultivos, el aislamiento y el cultivo de las bacterias para obtener el resultado diagnostico que determine o no la tuberculosis requiere al menos de 3 a 4 semanas, y después, se requiere un periodo de tiempo de más de 2 a 3 semanas para realizar las diversas pruebas sobre la identificación de las especies. Aunque se conoce otro procedimiento para detectar los bacilos tuberculosos en el que se usa el antígenoanticuerpo contra el género Mycobacterium, la especificidad hacia el bacilo tuberculoso es deficiente debido a la reacción cruzada entre las especies del género Mycobacterium, y como consecuencia de ello, a que la sensibilidad es insuficiente. Recientemente, se ha examinado una técnica de diagnóstico mediante la aplicación de técnicas de amplificación de ácido nucleico, tales como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), como un procedimiento útil, así como su aplicación en el diagnóstico del bacilo tuberculoso. Se ha estudiado si es posible usar diversas regiones de los genomas de ADN del bacilo tuberculoso como diana para detectar el bacilo tuberculoso mediante PCR. Por ejemplo, se ha publicado un procedimiento para detectar la región genética que codifica el antígeno de 65 kDa del género Mycobacterium (al que se hace referencia, p.ej., en el Documento no de patente 1, Documento no de patente 2, Documento no de patente 3, Documento no de patente 4 y Documento no de patente 5). Sin embargo, se sabe que el mismo género, tal como M. avium, M. fortuitum, M. paratuberculosis, M. kansasii, M. malmoense, BCG y M. marinum, así como Mycobacterium tuberculosis, tiene el gen del antígeno de 65 kDa conocido. Especialmente, como el antígeno de 65 kDa tiene una alta reactividad cruzada con M. avium o M. kansasii, que son los microorganismos representativos causantes de la micobacteriosis no tuberculosa, el procedimiento para detectar el gen del antígeno de 65 kDa sigue presentando un problema como procedimiento para detectar específicamente Mycobacterium tuberculosis. Además, se ha realizado un examen de prueba para identificar M. tuberculosis usando una secuencia genética que codifica la proteína MPB70, que fue identificada mediante ADN de Mycobacterium bovis (al que se hace referencia, por ejemplo, en el Documento no de patente 6). Sin embargo, Kulski, et al. publicaron el resultado en FEMS Microbiol. Lett., 1 de marzo de 1997; 148(1): 4348 (Documento no de patente 7). Concretamente, como resultado de un examen por PCR, se encontró la reacción cruzada con la secuencia similar en ADN de M. kansasii al usar la 2   proteína MPB70 como diana. Por consiguiente, este procedimiento continúa teniendo un problema como procedimiento para detectar específicamente Mycobacterium tuberculosis. Alternativamente, se ha publicado un procedimiento para detectar M. tuberculosis I bovis usando una secuencia de genes que codifica un antígeno proteico b (Pab) como marcador (al que se hace referencia, p. ej., en el Documento no de patente 8) y se ha confirmado la utilidad de este marcador para la detección de M. tuberculosis I Bovis. Sin embargo, como, en el caso del gen Pab, sólo puede existir una copia en el genoma de M. tuberculosis, no se considera tan preferible como material para dirigir la amplificación de ácidos nucleicos (por el contrario, en el caso de la secuencia de IS6110 descrita a continuación, existen diez copias en el genoma de M. tuberculosis). Además, se publicó que se puede utilizar la RFLP (Polimerización de longitudes de fragmentos de restricción), mediante el uso de IS6110 como sonda, para el diagnóstico de bacilos tuberculosos (a lo que se hace referencia en el Documento no de patente 9). Esta secuencia se ha usado ampliamente como importante herramienta para el estudio epidemiológico de la tuberculosis en muchos países del mundo. IS6110 es una secuencia de inserción específica del bacilo tuberculoso y existe de manera plural en el ADN cromosómico, con diferente número y ubicación en función de la cepa, y este carácter genético se hereda en cierto grado de manera estable. Por lo tanto, se muestran diferentes patrones de RFLP en función de la diferencia en la cepa, y puede ser posible el agrupamiento en base a sus orígenes. Existen muchos informes sobre el procedimiento de detección del bacilo tuberculoso usando IS6110 que indican una sensibilidad que supera el 75%, así como una especificidad de casi el 100%. Sin embargo, entretanto, también se ha publicado el resultado de un estudio que indica la posibilidad de que el procedimiento de detección genere falsos positivos con el uso de IS6110 (al que se hace referencia en el Documento no de patente 10). Aunque también se conoce un procedimiento de detección con PCR mediante el diseño de un cebador específico de IS6110 (al que se hace referencia, p. ej., en el Documento de patente 1, Documento de patente 2, Documento de patente 3 y Documento de patente 4), este procedimiento plantea el problema de que también se amplifican las secuencias relativas a IS6110 derivadas del género Mycobacterium que no pertenecen a M. tuberculosis. Además, las secuencias de tipo IS6110 existen en otras especies de microorganismos distintas del bacilo tuberculoso, y es por ello que se ha sugerido que estos microorganismos podrían ser detectables mediante el procedimiento de detección dirigido a IS6110. Por consiguiente, todos los procedimientos convencionales para detectar IS6110 presentan el problema de ser insuficientes en la detección específica de Mycobacterium tuberculosis. Además, el documento WO00/29613 (Documento de patente 16) revela una secuencia de oligonucleótido que abarca la secuencia complementaria de SEC ID N.º 1, que se usa como una sonda estándar para M. tuberculosis. Por consiguiente, existe la necesidad de establecer un procedimiento nuevo para detectar específicamente Mycobacterium tuberculosis. [Documento de patente 1]: JPA05507617. [Documento de patente 2]: JPA11514522. [Documento de patente 3]: JP No. 2814422. [Documento de patente 4]: USP No. 5370998. [Documento de patente 5]: JPA60500717. [Documento de patente 6]: JPA60281. [Documento de patente 7]: USP No. 5.210.015. [Documento de patente 8]: USP No. 5538848. [Documento de patente 9]: USP No. 5.801.155. [Documento de patente 10]: USP No. 5925517. [Documento de patente 11]: USP No. 6.492.121. [Documento de patente 12]: JP No. 2650159. [Documento de patente 13]: JPB07114718. [Documento de patente 14]: JPA58040099.... [Seguir leyendo]

1. Un oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, en la que A representa adenina, C representa citosina, G representa guanina y T representa timina, y T puede estar, en cualquier posición, sustituida por uracilo (U), y de aquí en adelante, se usarán las mismas abreviaturas, o una secuencia complementaria a la misma, en el que el oligonucleótido tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis. 2. El oligonucleótido de la reivindicación 1, que es un cebador para detectar Mycobacterium tuberculosis que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma, en el que el oligonucleótido tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis. 3. El oligonucleótido según la reivindicación 2, en el que el cebador está marcado con una sustancia de marcaje que se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en un radioisótopo, una enzima, una sustancia fluorescente, una sustancia luminiscente y una biotina. 4. El oligonucleótido de la reivindicación 1, que es una sonda para detectar Mycobacterium tuberculosis que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma, oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis. 5. El oligonucleótido según la reivindicación 4, en el que la sonda está marcada con una sustancia de marcaje, preferiblemente, (i) la sustancia de marcaje se selecciona del grupo que consiste en un radioisótopo, una enzima, una sustancia fluorescente, una sustancia luminiscente y una biotina; o (ii) el terminal 5 está marcado con un colorante fluorescente indicador y el terminal 3' está marcado con un colorante atenuador. 6. Un procedimiento para detectar Mycobacterium tuberculosis, que comprende usar un oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma, oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis, como un cebador o/y una sonda. 7. El procedimiento de detección según la reivindicación 6, procedimiento que incluye los siguientes procedimientos: (1) realizar la reacción en cadena de la polimerasa usando como cebador un oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma, en la que el oligonucleótido tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis; y un ácido nucleico de una muestra como molde; y (2) realizar una electroforesis del producto de la prolongación del cebador obtenido en el apartado (1) anterior y determinar la existencia de Mycobacterium tuberculosis en base al resultado obtenido, en el que en el apartado (1) anterior, preferiblemente, se usa como cebador directo un oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma, oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis; y como cebador inverso, se usa un oligonucleótido que comprende parte o la totalidad de la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 3 o SEC ID N.º 4, o parte o la totalidad de la secuencia complementaria a la misma, oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis. 8. El procedimiento de detección según la reivindicación 7, que comprende además, tras realizar la electroforesis, confirmar que una fracción del producto de prolongación del cebador tiene un número de pares de bases deseado en la fracción electroforética obtenida, procedimiento que comprende preferiblemente: (1) realizar la reacción en cadena de la polimerasa usando un oligonucleótido descrito en SEC ID N.º 1 como cebador directo y usando un oligonucleótido descrito en SEC ID N.º: 3 como cebador inverso, realizar una electroforesis del producto de prolongación del cebador obtenido y determinar si la muestra es una muestra positiva confirmando la existencia de una fracción de 178 pares de bases, o   (2) realizar la reacción en cadena de la polimerasa usando un oligonucleótido descrito en SEC ID N.º 1 como cebador directo y usando un oligonucleótido descrito en SEC ID N.º: 4 como cebador inverso, realizar una electroforesis del producto de prolongación del cebador obtenido y determinar si la muestra es una muestra positiva confirmando la existencia de una fracción de 193 pares de bases. 9. El procedimiento de detección según la reivindicación 7, que comprende además, después de realizar la electroforesis, hibridar la fracción electroforética obtenida con una sonda marcada, que es un oligonucleótido que comprende una parte o la totalidad de la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, SEC ID N.º 3, SEC ID N.º 4, SEC ID N.º 6, o una parte o la totalidad de la secuencia complementaria a la misma, en el que el oligonucleótido tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis, y que está marcado con una sustancia de marcaje, detectar la sustancia de marcaje de la sonda marcada y determinar si la muestra es una muestra positiva mediante la confirmación de una fracción hibridada con la sonda marcada; procedimiento que, preferiblemente, comprende realizar la reacción en cadena de la polimerasa usando un oligonucleótido descrito en SEC ID N.º 1 COMO cebador directo y usando un oligonucleótido descrito en SEC ID N.º 3 como cebador inverso, realizar la electroforesis, hibridar la fracción electroforética obtenida con una sonda marcada que sea un oligonucleótido que comprende una parte o la totalidad de la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 6 y que está marcado con una sustancia de marcaje, detectar la sustancia de marcaje de la sonda marcada y determinar si la muestra es una muestra positiva mediante la confirmación de una fracción hibridada con la sonda marcada. 10. El procedimiento de detección según la reivindicación 6, en el que el cebador está marcado con una sustancia de marcaje y el procedimiento incluye el procedimiento para realizar la reacción en cadena de la polimerasa usando el cebador marcado y el ácido nucleico de la muestra como molde, y medir la sustancia de marcaje del producto de prolongación del cebador obtenido; procedimiento que, preferiblemente, comprende además, tras realizar la reacción en cadena de la polimerasa, retirar un cebador marcado libre y medir la sustancia de marcaje del producto de prolongación del cebador, siendo lo más preferible que: (i) el procedimiento para retirar el cebador marcado libre tras realizar la reacción en cadena de la polimerasa incluya un procedimiento para precipitar el producto de prolongación del cebador en la mezcla de reacción obtenida y eliminar un sobrenadante; o (ii) el procedimiento para retirar el cebador marcado libre tras realizar la reacción en cadena de la polimerasa sea un procedimiento para tratar el producto de reacción obtenido por medio de cromatografía en gel. 11. El procedimiento de detección según la reivindicación 6, en el que la sonda está marcada con una sustancia de marcaje, y que incluye el procedimiento para hibridar la sonda marcada con el ácido nucleico de la muestra, retirar una sonda marcada libre y detectar la sustancia de marcaje del complejo hibridado. 12. un kit para detectar Mycobacterium tuberculosis, que comprende un oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma, en el que el oligonucleótido tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis, como un cebador o/y una sonda. 13. El kit según la reivindicación 12, en el que (i) el cebador está marcado con una sustancia de marcaje; o (ii) la sonda está marcada con una sustancia de marcaje. 14. El kit según la reivindicación 12, que comprende los siguientes reactivos constituyentes: (1) un cebador directo que es un oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma, en el que el oligonucleótido tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis, y (2) un cebador inverso que es un oligonucleótido que comprende una parte o la totalidad de la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 3 o SEC ID N.º 4, o una parte o la totalidad de la secuencia 51   complementaria a la misma, oligonucleótido que tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis; preferiblemente, dicho kit comprende además una sonda marcada obtenida mediante el marcaje de un oligonucleótido que comprende una parte o la totalidad de la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, SEC ID N.º 3, SEC ID N.º 4 o SEC ID N.º 6, o una parte o la totalidad de la secuencia complementaria a la misma, en la que el oligonucleótido tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis mediante una sustancia de marcaje. 15. El procedimiento según la reivindicación 6, en el que el procedimiento se realiza usando un par de cebadores que comprende: (1) oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma, en el que el oligonucleótido tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis, y (2) un oligonucleótido que comprende una parte o la totalidad de la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 3, SEC ID N.º 4, o una parte o la totalidad de la secuencia complementaria a la misma, en el que el oligonucleótido tiene la propiedad de hibridarse con la secuencia de ácido nucleico del gen IS6110 de Mycobacterium tuberculosis. 16. El procedimiento de detección según la reivindicación 6, procedimiento que incluye los siguientes procedimientos: (1) realizar la reacción en cadena de la polimerasa usando como cebador directo un oligonucleótido que consiste en la secuencia de ácido nucleico descrita en la SEC ID N.º 1, o una secuencia complementaria a la misma; y como cebador inverso, un oligonucleótido que comprende la secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 3, o la secuencia complementaria a la misma; y un ácido nucleico de una muestra como molde; y una sonda marcada obtenida mediante el marcaje de un oligonucleótido que comprende una secuencia de ácido nucleico descrita en SEC ID N.º 11, o una secuencia complementaria a la misma, con una sustancia de marcaje, y (2) detectar una señal procedente de la sonda marcada y (3) determinar si la muestra es una muestra positiva mediante la confirmación de la señal procedente de la sonda marcada. 52