Solución para extracción de gluten y métodos de uso.

SECTOR DE APLICACIÓN DE LA INVENCIÓN S La invención está dirigida fundamentalmente al ámbito de la analítica química de proteínas o péptidos que forman parte de alimentos. El sector preferente de aplicación será la Industria alimentaria y los laboratorios analíticos, y en general, todos los laboratorios que realicen análisis de detección de gluten o péptidos del gluten en 10 alimentos básicos, elaborados, procesados fisicoquímicamente e incluso biológicamente. Preferentemente, podrá ser aplicado en aquellos laboratorios que realicen extracción de gluten para ensayos de cuantificación basados en anticuerpos monoclonales como ELISAs, Western blots, detección de tiras inmunocromatográficas y biosensores. 15 ANTECEDENTES DE LA INVENCION La celiaquía es una intolerancia permanente al gluten, en individuos genéticamente predispuestos, que se manifiesta por una lesión grave de la mucosa del intestino delgado tras la ingestión de esta proteína que se encuentra presente en 20 determinados cereales como trigo, cebada, centeno y en menor medida, avena. (Col, S G and Kagnuff, M F. Celiac Disease. Annual review ofnutrition 1985, 5:241-266; Cooper, B T; Roles, G K T and Cooke, W T. Celiac disease and immunological disorders. British Medical Journal 1978, 1:537-539.) El gluten está compuesto por un conjunto de proteínas diferenciadas entre prolaminas (gliadina en trigo, hordeína en cebada, secalina 25 en Centeno y aveninas en avena) , dañinas para el enfermo celíaco, y gluteninas, actualmente en estudio sobre su potencial toxicidad en enfermos celíacos. (Shewr y , P R: Halford, N G; Belton, P S and Tatham, A S. The structure and properties of gluten: an elastic protein from wheat grain. The Royal Society. 2002) . La enfermedad celíaca se desencadena por la presencia de péptidos procedentes 30 de la fragmentación de las prolaminas, las cuales no son digeridas por las proteasas gastrointestinales y resultan ser tóxicas para los pacientes celíacos. La estructura peptídica es esencial para producir el efecto tóxico, ya que cuando los polipéptidos de las prolaminas se hidrolizan hasta los aminoácidos constituyentes, se pierde la capacidad lesiva para el intestino. Entre los "péptidos tóxicos" identificados el 35 denominado 33-mer, (ver lista de secuencias) que contiene 6 epítopos de reconocimiento de las células T, es uno de los péptidos más inmunogénicos presente en la gliadina y uno de los responsables de la reacción inmune que se desencadena en el intestino de los pacientes celíacos (Shan, L. y cols., Basis for gluten intolerance in celiac sprue. 2002, Science, 297:2275-2279; Sollid, L.M., eoeliac disease: dissecting a S complex inflammator y disorder 2002, Nat Rev Immunol., 2:647-655) . Estos autores demostraron mediante estudios in vitro e in vivo en ratas y en humanos, que el péptido 33-mer de la a-gliadina es muy resistente a la proteólisis enzimática gástrica, pancreática e intestinal. Estos péptidos pasan por la mucosa intestinal donde interaccionan con la transglutaminasa tisular, que transforma los residuos de glutamina 10 en ácido glutámico y, como consecuencia de ello, se producen una serie de cambios que desencadenan reacciones con base inmunológica, que acaban destruyendo las vellosidades intestinales. El único tratamiento existente a día de hoy consiste en una dieta estricta sin gluten (Fassano A Surprises from eeliac Disease. Scientific American, August 2009) 15 durante toda la vida del paciente, de ahí la importancia de que existan técnicas de cuantificación de gluten presente en alimentos. Existen diversos métodos de gran sensibilidad para detectar gluten de forma indirecta como es la detección de gluten por PeR (Reacción en cadena de la polimerasa) , que detecta el ADN de los cereales que contienen gluten. Esta técnica es muy sensible pero posee el inconveniente de que no 20 reconoce directamente a la proteína del cereal. Se asume que la proteína y el ADN del gluten están presentes siempre en relación proporcional, lo cual es dificil de sostener después de la variedad de tratamientos que sufren los alimentos. Los fragmentos del gluten también pueden detectarse de forma más directa por espectroscopia de masas MALDI TOFF, técnica instrumental que puede ser muy precisa y cuantitativa a la hora 25 de determinar los péptidos (fragmentos de proteínas) del gluten, pero precisa un instrumental muy costoso y necesita personal altamente especializado. Los métodos mediante técnicas de inmunoensayos a través de anticuerpos que reconocen secuencias de aminoácidos del gluten siguen siendo los más convenientes al unir sencillez, sensibilidad, economía, además de detectar directamente la proteína 30 inmunotóxica. Los primeros métodos para la detección y cuantificación de gluten existentes estaban basados en técnicas inmunoabsorbentes, pero todas ellas basadas en

anticuerpos policlonales (Ayob, M K; Rittenburg, J; Allen, J e and Smith, e S. Development of a rapid enzime linked immunosorbent assay for gliadin determination m food. Food Hydrocolloids, 1988, 2:39-49) . Actualmente se ha optimizado esta metodología utilizando anticuerpos monoclonales frente a epítopos específicos, evitando los problemas que surgen a la hora de utilizar anticuerpos policlonales que no pueden garantizar la reproducibilidad de lotes y tienen más falsos positivos (Sorell, E; S López, J A: Valdés, J; Alfonso, P; Camafaeita, J; Acevedo, B; Chirdo, F; Gavilondo, J and Méndez, M. An innovative Sandwich ELISA system based on an antibody Cocktail for gluten analysis. FEBS Letters 1988, 136:46-50) . La extracción del gluten de la matriz es un paso fundamental para la cuantificación de esta proteína mediante las técnicas antes mencionadas. Los protocolos 10 establecidos en la actualidad para la extracción de gluten comprenden el uso de soluciones de etanol-agua, normalmente en una proporción del 60-70% de etanol (Osborne T.B., The vegetable proteins, 2nd ed. London: Longmans, Green and co, 1924) . Sin embargo, la extracción no se puede llevar a cabo con estas soluciones cuando se trata de alimentos tratados con calor. Muchos de los alimentos para celiacos 15 son sometidos en su proceso de elaboración a altas temperaturas (150-220°C) , lo que resulta en un aumento de las interacciones proteicas y con ello se producen cambios estructurales en las gliadinas, provocando la desnaturalización de las fracciones tóxicas del gluten y haciéndolas insolubles. Una vez desnaturalizadas no pueden ser extraídas con las soluciones hidroalcohólicas convencionales. 20 Las técnicas inmunológicas existentes recogen el uso de anticuerpos como el R5 y el G12, en tiras inmunocromatográficas, ELISAs tipo Sandwich y ELISAs Competitivos. Éstos últimos surgen ante la necesidad de que la técnica reconozca prolaminas hidrolizadas, que pueden tener menos de dos epítopos, siendo ésta la cantidad mínima de epítopos a detectar con los ELISAs tipo Sandwich. Las soluciones 25 de extracción de gluten deben ser entonces compatibles con el uso de ambas técnicas. García y cols. (Development of a general procedure for complete extraction of gliadins for heat processed and unheated foods Eur. J. Gastroenterol. Hepatol. 2005, 17:529-539; US 7, 585, 529 B2 ) logran una mejora en la extracción especialmente en alimentos tratados con calor, utilizando para ello el efecto combinado de la solución 30 etanol-agua con agentes reductores y caotrópicos como el cloruro de guanidinio en una solución tamponada con fosfato a pH 7-8. Sin embargo, esta alternativa conocida por algunos expertos en la materia como Cocktail de Méndez, presenta inconvenientes

importantes como su incompatibilidad en los ELISAs Competitivos, en los que el anticuerpo se incuba con la muestra extraída produciendo la inactivación de dicho anticuerpo, además de proporcionar un olor desagradable y tener componentes peligrosos para su manipulación. El efecto desnaturalizante de las proteínas del cloruro de guanidinio, lo hace inviable en algunos ensayos inmunológicos en los que el S anticuerpo, conjugado o no a un enzima indicador, se pone en contacto con el extracto de muestra. Esto se... [Seguir leyendo]

l. Solución acuosa para la extracción analítica de gluten presente en alimentos , ingredientes alimenticios y bebidas caracterizada por contener argmma como agente solubilizante a una concentración entre O, 1M Y 2 M.

2. Solución acuosa para la extracción analítica de gluten según la reivindicación 1 con un pH comprendido entre 6 y 8, 5.

3. Solución acuosa para la extracción de gluten de las reivindicaciones 1 y 2 que contiene un agente reductor de puentes disulfuro.

4. Solución acuosa para la extracción de gluten según las reivindicaciones 1 y 2 que contiene también un tensioactivo.

5. Método para extracción analítica del gluten en alimentos usando la solución según alguna de las reivindicaciones 1 a 4 caracterizado por los siguientes pasos iniciales:

a. Homogenizar un gramo de muestra por cada 10 mL de dicha solución de extracción de la reivindicación 1 a 3.

b. Incubar esta mezcla de 5 a 60 minutos a una temperatura desde 20°C hasta 55°C, dependiendo de la muestra a analizar.

c. Dejar que se ponga la mezcla a temperatura ambiente.

d. Mezclar 3 volúmenes por cada volumen de extracto de una solución de etanol -agua en presencia de la composición, con un porcentaje de etanol que puede variar entr.

6. 80%.

e. Separación del sobrenadante que contiene el gluten extraído.

6. El método de la reivindicación 5, en el que la muestra se incuba con la solución de la composición según las reivindicaciones 1 a 4 durante al menos 5 minutos a una temperatura comprendida entre 45 y 55°C.

7. El método de la reivindicación 5, donde la solución etanol-agua adicionada después de la incubación con la solución de extracción de las reivindicación 1 a 4 presenta un porcentaje del 80% en etanol

8. El método de la reivindicación 5 donde la incubación de la mezcla compuesta por la muestra, la solución de la invención y la solución etanol-agua se incuban entre 2 y 60 minutos

9. Uso de la solución con la composición según las reivindicaciones l a 4 para determinación de gluten en alimentos, ingredientes alimenticios, y bebidas.

10. Uso de la solución según las reivindicaciones 1 a 4 para determinación de gluten mediante ensayos inmunológicos del tipo ELISA, tiras inmunocromatográficas,

Western blot, inmunopartículas fluorescentes, inmunopartículas magnéticas, o biosensores que usen anticuerpos.

11. Un kit para detectar gluten que comprenda la solución de las reivindicaciones 1 a 4 y componentes para hacer pruebas de ELISA para detectar péptidos del gluten.

12. Un kit para detectar gluten que comprenda la solución de las reivindicaciones 1 a 10 4, y tiras inmunocromatográficas para detectar péptidos del gluten.