DETERMINACIÓN RAPIDA DE SUSCEPTIBILIDAD A COMPUESTOSANTIMICROBIANOS.

La presente invención se refiere a métodos e instrumentos para la determinación de susceptibilidad a distintos compuestos por parte de diferentes microorganismos.

Más específicamente, se refiere a la determinación de susceptibilidad a antibióticos por parte de microorganismos patógenos multirresistentes. La presente invención hace referencia a la utilización de un componente iónicamente entrecruzable utilizado para la producción de microesferas mediante técnicas de microencapsulación. La presente invención se refiere también a una metodología para el análisis de la proliferación microbiana dentro de esas cápsulas y a la interpretación de los mismos.

DETERMINACIÓN RÁPIDA DE SUSCEPTIBILIDAD A COMPUESTOS

ANTIMICROBIAN O S

Estado del arte

La presente invención se refiere a métodos e instrumentos para la determinación de susceptibilidad a distintos compuestos por parte de diferentes microorganismos. Más específicamente, se refiere a la determinación de susceptibilidad a antibióticos por parte de microorganismos patógenos multirresistentes. La presente invención hace referencia a la utilización de un componente iónicamente entrecruzable utilizado para la producción de microesferas, dichas microesferas serán producidas mediante la aplicación de técnicas de microencapsulación, más específicamente de una tecnología de encapsulación mediante flowfocusing, que garantiza una producción monodispersa de microesferas. La presente invención hace referencia también a una metodología para el análisis de la proliferación microbiana dentro de esas cápsulas y a la interpretación de los mismos.

La determinación de susceptibilidad a antibióticos es un procedimiento con una importancia crucial en los laboratorios microbiológicos clínicos para la definición del tratamiento óptimo frente a una determinada infección microbiana. Los tratamientos empíricos se siguen llevando a cabo en aquellas infecciones causadas por microorganismos que todavía no han desarrollado mecanismos de resistencias a antibióticos, sin embargo, la proliferación de microorganismos que han incorporado diversos mecanismos de resistencia ha aumentado exponencialmente, incrementando así el riesgo de implementar terapias antibióticas incorrectas por determinaciones deficitarias de la resistencia.

Existen numerosas técnicas para la determinación de la susceptibilidad a antibióticos, las técnicas clásicas descritas en los 1970s, revisadas por Jorgensen y Ferraro en Antimicrobial Susceptibility testing: A review of general principies and contemporary practices; Medical Microbiology CID 2009: 49.

Entre estas técnicas clásicas cabe destacar las diluciones seriadas en medio de crecimiento microbiano con crecientes concentraciones de antibiótico y la técnica de difusión de disco de

Bauer-Kirby (1966) (Woods gl, Washington JA. Antimicrobialsusceptibilitytests: dilution and disk diffusionmethods).

En las técnicas clásicas se necesitan 72h desde el procesamiento de la muestra hasta la obtención de los resultados de los ensayos de susceptibilidad. 24 horas para el crecimiento en placa, 24 horas para el aislamiento de clones y 24 h para la determinación de la susceptibilidad a antibióticos.

La reducción del tiempo hasta la consecución de resultados objetivos, sin afectar la precisión y la reproducibilidad, para la implementación de la terapia correcta es de crucial importancia

en los laboratorios clínicos microbiológicos.

El desarrollo de técnicas para la reducción de este tiempo de procesamiento ha centrado el esfuerzo de numerosas empresas de biotecnología y grupos de investigación.

Entre los avances descritos en el estado del arte, se encuentran los sistemas automatizados, con ellos se consigue reducir a 3,5h para determinaciones de gram negativas en el MicroScanWalkAway (Siemens HealthCareDiagnostics) a 18h en el Sensititre AIRIS 2x (TrekDiagnosticsSystmes). Estos sistemas, basados en el análisis de la proliferación microbiana basándose en técnicas fluorimétricas, además de reducir el tiempo incrementan la objetividad debido a la mecanización de los procesos y a la disminución de los errores en la realización de los procedimientos. Sin embargo, hay microorganismos más complejos que requieren de incubaciones más largas por lo que la reducción del tiempo no es igual en todos los casos. Los inconvenientes de estos sistemas son generalmente el alto precio tanto de implementación como de mantenimiento, así como el hecho de que son sistemas cerrados, con un determinado formato predefinido y una serie de microorganismos para los que son válidos que no siempre coinciden con los requerimientos de un determinado entorno clínico.

La encapsulación celular y su aplicación en clínica está descrita en la bibliografía desde 1960s (CHANG TMS (1964) Semipermeable microcapsules. Science 146(3643):524-525., Chang T.M.S. Artificial Cells, Spingfield, III. Charles C Thomas (1972)).

En el campo que nos ocupa de la determinación de susceptibilidad a antibióticos, se han ido aplicando técnicas de encapsulación para el análisis individualizado de microorganismos. El concepto más extendido es el de ensayo de crecimiento por microgotas en gel o GMD (gel microdrop) (patente EP0411038A1), en el, se encapsulan los microorganismos en gotas de

agarosa y se analiza el crecimiento de los microorganismos dentro de los mismos en determinados condiciones (Journal of Microbiologicalmethods 62 (2005)181-197).

Esta tecnología presenta algunas desventajas, en primer lugar las encapsulaciones se realizan con agarosa, esta agarosa necesita una temperatura elevada para poder utilizarla, sometiendo a los microorganismos a temperaturas superiores a los 40°C. Además el procedimiento para la realización de los microgotas es por emulsión con un aceite, esto hace que se necesiten numerosos pasos posteriores para la eliminación del aceite con el consiguiente sufrimiento celular y la imposibilidad de uso del sistema para microorganismos más sensibles a la temperatura o al estrés. Sin embargo el sistema es muy bueno porque permite el análisis individualizado del crecimiento bacteriano, reduciendo el número de divisiones necesarias para hacer patente un efecto del compuesto analizado sobre el crecimiento celular. Un problema añadido al sistema es la variabilidad en el tamaño de las capsulas producidas, mediante las emulsiones es muy difícil controlar el tamaño de la capsula y por tanto la cantidad de bacterias en ellas. La obtención de resultados a partir de estas técnicas se realiza a través de citometría de flujo, esta técnica aunque muy precisa y consistente, tiene el problema del tamaño máximo que puede analizar, teniendo en cuenta lo mencionado anteriormente sobre el poco control que hay sobre el tamaño de capsulas cuando se produce por emulsión, requiere un paso previo al análisis de filtrado, esto puede inducir un error en el análisis al descartar una población de capsulas por su tamaño. Además la citometría de flujo requiere de una capacitación del personal que lo maneja, y esto dificulta su introducción en el ámbito clínico que estamos tratando.

En esta misma línea de desarrollo, se han publicado distintas técnicas para la determinación de susceptibilidad a antibióticos basados en análisis individualizados de crecimiento celular. En el caso del artículo publicado en Labon Chip en 2013 (Lab Chip, 2013,13,280), utilizan un sistema de microfluídica para fijar las bacterias en unos canales de agarosa, mediante difusión, se ponen en contacto con un gradiente de concentración del antibiótico analizado y mediante un análisis por microscopía, se determina que concentración inhibe el crecimiento del microorganismo en cuestión. Este sistema, reduce mucho el tiempo hasta la obtención de resultados a 3h, sin embargo, la lectura de los resultados necesita de un tratamiento de imágenes complejo que permita diferenciar si esas células están en crecimiento o no. Además de los inconvenientes debidos a la utilización de agarosa (temperatura) y de microfluídica (manejo).

Una combinación de las dos técnicas anteriores es la aplicación de microfluídica para la encapsulación de microorganismos y su análisis de susceptibilidad a diversos compuestos (ACS ChemicalBiology 2011,6, 260-266) mediante la aplicación de microfluídica para la producción de capsulas monodispersas mediante flow-focusing, conteniendo 1-0 bacterias y el análisis del crecimiento de las mismas dentro de las capsulas por citometría de flujo, en este caso, siguen utilizando agarosa, con el consiguiente requerimiento térmico necesario para su manejo. Además utilizan el citómetro para la obtención de resultados cuyos inconvenientes han sido discutidos con anterioridad.

Enfocamiento de chorro®es una tecnología de manipulación de microfluidos para la generación de gotas monodispersas, basada en la producción de microchorros capilares que son "enfocados" hacia un orificio (US6,464,886). Descubierta en 1994 por el grupo de investigación del profesor Alfonso Gañán-Calvo. Esta tecnología permite diseñar y producir micropartículas con tamaño, estructura y composición seleccionables. Esta tecnología se ha desarrollado hasta un instrumento (Cellena ®) que permite la encapsulación mediante FlowFocusing® de células manteniendo su viabilidad mediante la utilización de polímero de gelificación iónica como el alginato, ampliamente... [Seguir leyendo]

1- Un procedimiento para la determinación de patrones de susceptibilidad a antibióticos de microorganismos caracterizado por:

a. Una muestra que contiene el de microorganismo que se mezcla con una solución

con una sustancia gelificante

b. Un sistema de enfocamiento de flujo que produce gotas monodispersas de entre 30 y 300 um de tamaño a partir de esa mezcla de células con hidrogeles y que acaban gelificando formando microesferas conteniendo al microorganismo objeto del estudio

c. Incubación de al menos dos series de dichas microesferas en un medio de cultivo,

un tiempo y una temperatura que permita al menos 3 generaciones de los microorganismos a estudiar en ausencia de los distintos compuestos antimicrobianos cuyas actividades se quieren evaluar y en el que al menos una serie es incubada en presencia de los compuestos antimicrobianos a probar.

d. Análisis del tamaño y del número de las microcolonias formadas mediante un

analizador de imágenes en muestras de microesferas incubadas en presencia y en ausencia de dichos compuestos antimicrobianos.

2-.Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque la muestra es una muestra clínica tomada directamente del paciente humano.

3-, Procedimiento según las reivindicaciones 1 y 2 donde la muestra clínica sufre un

procedimiento de 30 minutos previo a su inoculación en la sustancia gelificante.

4- , Procedimiento según las reivindicaciones 1-3 según el cual se diluye la muestra clínica al menos 50 veces en una solución.

5- , Procedimiento según las reivindicaciones 1-4 según el cual se somete a vortex o agitación 25 la muestra diluida durante al menos 1 minuto.

6- , Procedimiento según las reivindicaciones 1-5 según el cual se inocula esta dilución en 1 mL de sustancia gelificante.

7- , Procedimiento según las reivindicación 1 donde la muestra procede de un cultivo axenico o puro.

8- , Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque la sustancia capaz de producir hidrogeles contiene alginato,

9- Procedimiento según la reivindicación 1 y 9 caracterizado porque gelifica cuando las gotas que entran en una solución con iones de calcio..

10- Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque la solución con los microorganismos y la sustancia gelificante generan microgotas monodispersas a través de un dispositivo de enfocamiento de chorros,

11- Procedimiento según la reivindicación 1 caracterizado porque las microesferas tienen un tamaño entre 80-200 pm

12- Procedimiento según las reivindicaciones 1,8 a 11 caracterizado por que las microesferas se incuban en medio de cultivo que permita el crecimiento de los microorganismos objetos del estudio.

13- Procedimiento según las reivindicaciones 1, 8 a 12 caracterizado por que se aíslan distintas muestras de microesferas en distintos recipientes a los que se añaden compuestos inhibidores del crecimiento microbiano del tipo de los antibióticos, antifúngicos, sulfamidas, y otros compuestos cuya actividad inhibidora se quiera determinar frente a los microorganismos en las microesferas..

14- Procedimiento según las reivindicaciones 1,8 a 13por las que los compuestos inhibidores se encuentra a distintas concentraciones.

15- Procedimiento según la reivindicación 1 y cualquiera de las reivindicaciones de la 8 a 14 caracterizado porque las microesferas y las células microencapsuladas son analizadas por un microscopio y un programa de análisis de imagen que identificarían crecimiento celular midiendo los diámetros de microcolonias.