Procedimiento de separación de proteínas recombinantes en sistemas acuosos de dos fases.

La presente invención se refiere a un procedimiento para el reparto, separación y purificación en solución acuosa de proteínas recombinantes, basado en la utilización de polipéptidos con afinidad por colina. El procedimiento de la invención representa una forma económica y escalable de separación de proteínas recombinantes etiquetadas preferentemente con dominios de unión a colina

Procedimiento de separación de proteínas recombinantes en sistemas acuosos de dos fases.

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a un procedimiento para separar polipéptidos o proteínas fusionadas con una secuencia polipeptídica de unión a colina, que presenta además afinidad por un polímero soluble en agua, y que determina un reparto asimétrico del polipéptido o proteína de fusión en sistemas acuosos de dos fases, una de la cuales es rica en dicho polímero. El procedimiento permite una rápida separación de la proteína de fusión a partir de una mezcla compleja de proteínas presentes en un extracto celular, en un proceso simple que puede servir para la purificación del polipéptido o proteína de interés. El proceso de purificación incluye uno o más pasos de lavado y se completa con una inversión en el reparto de la proteína de fusión inducida por la adición al sistema del ligando natural del polipéptido de afinidad. El sector de la técnica al que puede aplicarse esta invención comprende por tanto la producción, separación y eventual purificación de polipéptidos y proteínas de interés biotecnológico, ya sea con fines industriales, agronómicos, terapéuticos o de diagnóstico en biomedicina, o como herramienta de investigación y análisis en el ámbito de las ciencias de la vida.

Estado de la técnica

La inmovilización de enzimas en soportes sólidos es un procedimiento habitual tanto para proceder a su purificación mediante técnicas cromatográficas como para la construcción de reactores enzimáticos para llevar a cabo todo tipo de biotransformaciones (Mosbach, K., ed. Immobilized Enzymes and Cells Part B. Methods in Enzymology. Vol. 135. 1987). Para ello se ha desarrollado una gran variedad de sistemas de inmovilización tanto covalente como no covalente. En determinados casos, es útil emplear una fusión de la proteína de interés con un polipéptido o "tag" de afinidad que posibilite una interacción fuerte y específica con el soporte sólido (Uhlen, M., et al., Fusion proteins in biotechnology. Curr Opin Biotechnol, 1992. 3(4): p. 363-9; Waugh, D.S., Making the most of affinity tags. Trends Biotechnol, 2005. 23(6): p. 316-20). Sin embargo, con mucha frecuencia la inmovilización de enzimas en matrices sólidas origina un cambio en las características de la proteína, tanto a nivel estructural como funcional. Así, por ejemplo, las peculiaridades físico-químicas del soporte pueden influir en la difusión del sustrato a la fase enzimática, o del producto a la fase móvil, provocando un cambio en las constantes cinéticas de la enzima que en muchas ocasiones se traduce en la reducción de la eficiencia del proceso y, en cualquier caso, en la necesidad de realizar costosos estudios de puesta a punto. Por otro lado, el escalado de los procedimientos cromatográficos para su utilización industrial conlleva una serie de dificultades técnicas que resultan fundamentalmente de la compresibilidad de los materiales y la necesidad de aplicar altas presiones en columna. Por este motivo, recientemente se están desarrollando nuevos métodos en solución que constituyan una alternativa al empleo de materiales sólidos. En este sentido, los sistemas de dos fases acuosos se generan espontáneamente por la mezcla de ciertas soluciones de dos polímeros estructuralmente diferentes, o por la mezcla de un polímero (normalmente polietilenglicol o PEG) y altas concentraciones de una sal (Johansson, H.W.a.G., ed. Aqueous Two-Phase Systems. Methods in Enzymology. Vol. 228. 1994; Guan, Y., et al., New approaches to aqueous polymer systems: Theory, thermodynamics and applications to biomolecular separations. Pure and Applied Chemistry, 1995. 67(6): p. 955-962; Andrews, B.A., A.S. Schmidt, and J.A. Asenjo, Correlation for the partition behavior of proteins in aqueous two-phase systems: effect of surface hydrophobicity and charge. Biotechnol Bioeng, 2005. 90(3): p. 380-90). Tras un corto periodo aparecen dos fases, ambas acuosas, y que se encuentran en equilibrio. En mezclas de dos polímeros, cada fase se enriquece en uno de los dos polímeros, mientras que en sistemas polímero-sal una fase se enriquece en polímero, y la otra en sal. Las propiedades químico-físicas de estas mezclas han sido ampliamente estudiadas (Cabezas, H., Jr., Theory of phase formation in aqueous two-phase systems. J Chromatogr B Biomed Appl, 1996. 680(1-2): p. 3-30) y se han construido diagramas binodales que señalan los rangos de concentración de cada uno de los compuestos que dan lugar a la separación de fases. Las líneas denominadas "tie lines" indican las concentraciones finales de cada polímero en cada fase una vez separadas éstas, así como los volúmenes relativos de cada una de las fases (Johansson, H.W.a.G., ed. Aqueous Two-Phase Systems. Methods in Enzymology. Vol. 228. 1994). Los sistemas acuosos de dos fases tienen una gran utilidad en la separación de material biológico (Hustedt, H., K.H. Kroner, and M.R. Kula, Applications of phase partitioning in biotechnology, in Partitioning in Aqueous two-phase systems: theory, methods uses and applications in biotechology, H. Walter, D.E. Brooks, and D. Fisher, Editors. 1985, Academic Press: Orlando, FL,. p. 529-587; Persson, J., et al., Purification of recombinant and human apolipoprotein A-1 using surfactant micelles in aqueous two-phase systems: recycling of thermoseparating polymer and surfactant with temperature-induced phase separation. Biotechnol Bioeng, 1999. 65(4): p. 371-81). Tienen varias ventajas, tales como alta biocompatibilidad, baja tensión superficial (lo que minimiza la degradación de las biomoléculas), alta capacidad de carga y rendimiento, y son fácilmente escalables (Albertsson, P.A., Partition of cell particles and macromolecules. 1986, New York: Wiley; Walter, H., G. Johansson, and D.E. Brooks, Partitioning in aqueous two-phase systems: recent results. Anal Biochem, 1991. 197(1): p. 1-18). En procesos de catálisis enzimática, la transferencia de masa (sustratos y productos) entre la fase enzimática y el resto está mucho más facilitada que cuando la enzima se adsorbe sobre una superficie sólida. Además son sistemas económicos, y en los que se pueden manejar muchos factores para conseguir mejorar la partición de la molécula de interés. El reparto de proteínas entre las dos fases es dependiente de factores tales como la carga, el tamaño y la hidrofobicidad de la proteína en cuestión, y es una cuestión en general poco predecible. De hecho, la mayor implantación en el mercado de estos sistemas viene limitada por la baja predictibilidad en la partición de las proteínas. Sin embargo, el uso de polipéptidos o "tags" de afinidad fusionados a la proteína de interés puede inducir a su localización en una u otra fase de una manera más controlada, lo que se denomina partición por afinidad en sistemas acuosos de dos fases. Se han descrito resultados prometedores usando el conocido "tag" de hexahistidina (Chung, B.H., D. Bailey, and F.H. Arnold, Metal affinity partitioning, in Aqueous Two-Phase Systems, H.W.a.G. Johansson, Editor. 1994. p. 167-277; Birkenmeier, G., et al., Immobilized metal ion affinity partitioning, a method combining metal-protein interaction and partitioning of proteins in aqueous two-phase systems. J Chromatogr, 1991. 539(2): p. 267-77). En este sistema, la proteína fusionada a la cola de histidinas es dirigida de manera mayoritaria a la fase rica en PEG, que ha sido previamente derivatizado de manera covalente con iones metálicos. Asimismo también se han estudiado las secuencias de tirosinas (Fexby, S., et al., Partitioning and characterization of tyrosine-tagged green fluorescent proteins in aqueous two-phase systems. Biotechnol Prog, 2004. 20(3): p. 793-8) o de triptofanos (Collen, A., et at., Genetic engineering of the Trichoderma reesei endoglucanase I (Cel7B) for enhanced partitioning in aqueous two-phase systems containing thermoseparating ethylene oxide-propylene oxide copolymers. J Biotechnol, 2001. 87(2): p. 179-91) en tales procedimientos de partición por afinidad.

Los módulos de unión a colina (CBM, "choline-binding modules") constituyen una familia de polipéptidos que forman parte de las denominadas proteínas de unión a colina (CBP, "choline-binding proteins"), presentes en una variedad de microorganismos (Swiatlo, E. and et. al., Choline-binding proteins., in The Pneumococcus, E.I. Tuomanen, T.J. Mitchell, and D.A. Morrison, Editors. 2004, American Society for Microbiology: Washington, DC. p. 49-60). Los CBMs constan a su vez de la repetición de secuencias...

1. Procedimiento para el reparto o separación de proteínas o polipéptidos caracterizado porque comprende:

a) poner en contacto

de modo que la mezcla resultante se estructura espontáneamente en un sistema binario de dos fases acuosas, A y B, donde la fase A contiene una mayor concentración de polietilenglicol en la que queda retenida mayoritariamente la proteína o polipéptido de fusión;

b) opcionalmente revertir la unión al polietilenglicol de la proteína o polipéptido de fusión mediante la adición de una solución conteniendo colina.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración total de polietilenglicol en el sistema binario está comprendida entre el 3 y el 15%.

3. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 2, caracterizado porque la sal presente en la fase B del sistema binario se selecciona entre una sal de fosfato, una sal de citrato, una sal de sulfato o una mezcla de estas sales.

4. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 3 caracterizado porque la sal presente en la fase B del sistema binario contiene fosfato potásico a una concentración comprendida entre el 5 y el 15%, y el pH de la mezcla tiene un valor comprendido entre 6.0 y 9.0.

5. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 2, caracterizado porque el polímero presente en la fase B del sistema binario es dextrano o derivados a una concentración comprendida entre el 5 y el 10% y el pH de la mezcla tiene un valor comprendido entre 6.0 y 9.0.

6. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 2, caracterizado porque el polímero presente en la fase B del sistema binario es almidón o derivados a una concentración comprendida entre el 5 y el 10% y el pH de la mezcla tiene un valor comprendido entre 6.0 y 9.0.

7. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 6, caracterizado porque el polipéptido de fusión a una secuencia con afinidad a colina es derivado del dominio C-terminal de la amidasa LytA de Streptococcus pneumoniae.

8. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 7, caracterizado porque el extracto celular o medio extracelular de un cultivo celular proviene de hibridomas, hongos, levaduras o bacterias.

9. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 8, caracterizado porque además comprende la etapa de eliminación de las proteínas del extracto celular o medio de cultivo extracelular que no se acumulan en la fase rica en polietilenglicol descartando la fase contraria a la fase rica en polietilenglicol.

10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación anterior 9, caracterizado porque tras separar la fase rica en polietilenglicol, se eliminan cuantitativamente las proteínas que no se acumulan en la fase rica en polietilenglicol mediante las siguientes etapas:

11. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 10, caracterizado porque la fase rica en PEG conteniendo la proteína de interés se utiliza directamente para obtener el polipéptido o proteína de interés con el dominio de unión a colina en forma purificada.

12. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 11, caracterizado porque se revierte la unión al polietilenglicol de la proteína o polipéptido de fusión mediante la adición de una solución conteniendo colina a una concentración superior a 50 mM.

13. Uso de la proteína o polipéptido de fusión retenida en la fase A rica en polietilenglicol según la reivindicación 1, como biocatalizador en un reactor enzimático para catalizar una reacción de interés en fase acuosa, pudiéndose recuperar el producto de dicha reacción en la fase pobre en polietilenglicol.

14. Uso del dominio C-terminal de la amidasa LytA de Streptococcus pneumoniae como polipéptido de unión a colina para el reparto o separación de proteínas o polipéptidos de fusión a secuencias polipeptídicas con afinidad a colina según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

15. Kit para realizar un procedimiento de separación de proteínas según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 12 que comprende los siguientes componentes: