Un complejo microparticulado inmunoestimulatorio estabilizado que comprende un inmunógeno de péptido catiónico en donde

el inmunógeno de péptido comprende un antígeno de célula B objetivo o un epítopo CTL y un epítopo de célula cooperador T y un oligonucleótido CpG aniónico en donde el inmunógeno de péptido catiónico tiene una carga positiva neta a un pH en el rango de 5.

0 a 8.0 calculado al asignar un carga +1 para cada lisina (K), arginina (R) o histidina (H), una carga -1 para cada ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) y una carga de 0 para todos los otros aminoácidos en el inmunógeno de péptido y

en donde el oligonucleótido CpG aniónico tiene una carga negativa neta a un pH en el rango de 5.0-8.0 y es un ADN de hebra sencilla que comprende 8 a 64 bases de nucleótido con una repetición de un motivo de citosina-guanidina y el número de repeticiones del motivo CpG está en el rango de 1 a 10, y en donde el inmunógeno de péptido catiónico : la relación de carga de oligonucléotido CpG varía de 8:1 a 1:2.

Sistema de suministro de inmunógeno sintético estabilizado.

Campo de la invención

La presente invención se relaciona con un complejo inmunoestimulador estabilizado y un método para preparar el complejo inmunoestimulador estabilizado. Más específicamente, la presente invención proporciona complejos inmunoestimuladores sintéticos estabilizados que son útiles en sistemas de suministro de vacuna con respuestas inmunes mejoradas in vivo. Estos complejos inmunoestimuladores también son útiles para preparar formulaciones de vacuna diseñadas para funcionar como un depósito para la liberación controlada del complejo inmunoestimulador. El complejo inmunoestimulador también se puede incorporar en formulaciones diseñadas para dirigir los tipos celulares específicos para mejorar sinérgicamente la calidad de las respuestas inmunes provocadas.

Antecedentes de la invención Se han empleado exitosamente vacunas durante muchos años en composiciones profilácticas para la prevención de enfermedades infecciosas y más recientemente en composiciones terapéuticas para el tratamiento de cánceres y enfermedades no infecciosas.

Tradicionalmente las vacunas se han derivado de patógenos bacterianos o víricos muertos o atenuados y se han probado que son muy efectivas contra enfermedades tales como virus de polio y Bordetella pertussis. A pesar de este éxito, existen crecientes preocupaciones sobre la seguridad de tales vacunas. Esto ha conducido al desarrollo de vacunas subunitarias derivadas de componentes de estos patógenos o inmunógenos de péptido completamente sintéticos.

Ejemplos de vacunas subunitarias incluyen toxoide del Tétano y antígeno de superficie de hepatitis B. Estos antígenos son a menudo pobremente inmunogénicos y requieren adyuvantes para mejorar las respuestas inmunes obtenidas. También los compuestos biológicamente activos caracterizados tales como péptidos sintéticos son los sustratos preferidos para inducir respuestas biológicas, para propósitos reguladores y de seguridad. Sin embargo, estos inmunógenos no son óptimos, e inducen respuestas protectoras parciales o insignificantes en modelos de animal. Los péptidos sintéticos requieren estabilización y adyuvantación para la inducción de una respuesta inmune efectiva in vivo.

Se han empleado diversos métodos para proteger los inmunógenos de péptido sintéticos contra la degradación in vitro e in vivo, mediada por diversos procesos que incluyen las rutas químicas y físicas.1 (Los números en superíndice se refieren a publicaciones, que describen más completamente el estado de la técnica a la que pertenece esta invención. La descripción de estas referencias se incorpora aquí como referencia. La cita de cada referencia se encuentra al final de esta sección) .

Se han empleado diversos métodos para mejorar la solubilidad del péptido o proteger un péptido contra la degradación in vivo.2 Estos incluyen de manera general procedimientos simples como modificar la concentración de sal y/o el pH de la solución. También se han modificado químicamente los péptidos mediante conjugación con compuestos solubles en agua como polietilenglicol (PEG) u óxido de polietileno (PEO) para mejorar su solubilidad acuosa y tiempo de circulación in vivo.3 Se ha documentado que lo adyuvantes derivados de PEG o PEO pueden regular por disminución el sistema inmune.4 Así, no se esperaría que los péptidos modificados PEG o PEO funcionen efectivamente como adyuvantes. La adición de múltiples lisinas para agregar carga a un péptido puede mejorar su solubilidad acuosa pero no resultan de manera general en inmunogenicidad mejorada.

El objetivo de estas diversas estrategias es mejorar el tiempo de circulación in vivo o minimizar o eliminar los problemas de inmunogenicidad asociados con las condiciones físicas (por ejemplo sal, pH, temperatura, tipo de regulador) y/o incompatibilidades químicas cuando se emplean péptidos en una formulación de vacuna.

Los copolímeros de bloque de poliéter, que comprenden polímeros policatiónicos, se describen por Kabanov et al., Patente Estadounidense No. 5, 656, 6115 para estabilizar polinucleótidos u oligonucleótidos. Se emplean los complejos de polinucleótido-copolímero de bloque de poliéter para facilitar el transporte del polinucleótido a través de una membrana celular para actividad biológica mejorada. Sin embargo, estos copolímeros de bloque poliéterpolinucleótido no son inmunogénicos y no son adecuados como vacunas.

Allcock et al., patente Estadounidense No. 5, 562, 9096 describe un inmunoadyuvante derivado de polielectrolitos fosfazeno. El inmunoadyuvante se mezcla directamente con un antígeno en la solución y se puede preparar como micropartículas al secar por rociado una solución del polímero y el antígeno o mediante un proceso descrito por Cohen en la patente Estadounidense No. 5, 149, 543.7. Aunque, se muestra adyuvanticidad aumentada para estos

sistemas, existen dificultadas en la preparación de composiciones microparticulares debido a los procesos mecánicos complicados empleados, que serían difíciles de aumentar a escala para producción comercial. Adicionalmente, la estabilidad del complejo de polímero-antígeno así formado es altamente dependiente de la concentración de sal y las condiciones de pH.

Un método diferente se describe en Moss et al. WO91/040528, en donde se prepara una composición de vacuna sólida de un antígeno, que puede ser un péptido, una saponina y un adyuvante policatiónico tal como DEAEdextrano. Las vacunas formuladas a partir de esta combinación proporcionan longevidad mejorada, haciendo tales combinaciones adecuadas para uso como implantes. Sin embargo, el antígeno primero se puede conjugar químicamente con una molécula portadora y se purifica exhaustivamente. El antígeno-portador purificado luego se combina con una saponina y un adyuvante policatiónico para proporcionar una composición sólida. Este proceso no proporciona control sobre las propiedades físicas, tal como tamaño de partícula, del producto.

Se han desarrollado numerosos adyuvantes y/o sistemas de suministro transdérmico, de mucosa, o parenterales basados en depósito destinados para el uso con vacunas humanas o veterinarias para mejorar la respuesta inmune. Estas incluyen el uso de sales minerales, emulsiones agua en aceite (w/o) , liposomas, micropartículas poliméricas, nanopartículas y geles/hidrogeles.9 Se han conducido un gran número de ensayos clínicos que emplean diversas composiciones de emulsión (w/o) .

A pesar de este inmenso conjunto de investigación clínica, las formulaciones parenterales típicas, administradas subcutáneamente o intramuscularmente, se preparan con adyuvantes derivados de sales de aluminio, tales como fosfato de aluminio o hidróxido de aluminio. Las sales de alumbre son adecuadas y efectivas para muchas vacunas con base en patógenos atenuados, patógenos muertos y antígenos subunitarios derivados de agentes biológicos. Sin embargo, los adyuvantes con base en aluminio son a menudo totalmente inefectivos para inmunógenos con base en péptido sintético debido a la gran dosis de péptido requerido y a la necesidad de adyuvantación mucho más fuerte. La combinación de una gran dosis de inmunógeno con un alumbre que funciona débilmente como adyuvante en una composición de vacuna no es ideal cuando puede conducir a tolerancia al inmunógeno y reactogenicidad, es decir, reacciones colaterales indeseadas, tales como inflamación y enrojecimiento en el sitio de la inyección.

El adyuvante completo de Freund (FCA) , una suspensión de micobacterias de M. tuberculosis muertas con calor en aceite mineral que contiene un tensoactivo, se ha reconocido como uno de los adyuvantes más poderosos. Sin embargo, se han documentado las reacciones adversas severas, varían de irritación menor a las lesiones y abscesos estériles en el sitio de inyección. Debido a estas reacciones adversas, se ha excluido el FCA de las aplicaciones humanas y veterinarias.

Así, subsiste una clara necesidad de desarrollar adyuvantes que son seguros sin problemas toxicológicos y/o reactogénicos asociados con alumbre o FCA y pueden mejorar efectivamente la inmunogenicidad y prolongar la efectividad de los inmunógenos de péptido para evitar el problema de tolerancia asociado con alumbre. También es más deseable desarrollar composiciones y métodos, que pueden, estabilizar un inmunógeno de péptido y las respuestas inmunes de adyuvante en una composición única.

Jones et al.10 ha descubierto dos... [Seguir leyendo]

1. Un complejo microparticulado inmunoestimulatorio estabilizado que comprende un inmunógeno de péptido catiónico en donde

el inmunógeno de péptido comprende un antígeno de célula B objetivo o un epítopo CTL y un epítopo de célula cooperador T y un oligonucleótido CpG aniónico en donde el inmunógeno de péptido catiónico tiene una carga positiva neta a un pH en el rango de 5.0 a 8.0 calculado al asignar un carga +1 para cada lisina (K) , arginina (R) o histidina (H) , una carga -1 para cada ácido aspártico (D) o ácido glutámico (E) y una carga de 0 para todos los otros aminoácidos en el inmunógeno de péptido y en donde el oligonucleótido CpG aniónico tiene una carga negativa neta a un pH en el rango de 5.0-8.0 y es un ADN de hebra sencilla que comprende 8 a 64 bases de nucleótido con una repetición de un motivo de citosina-guanidina y el número de repeticiones del motivo CpG está en el rango de 1 a 10, y en donde el inmunógeno de péptido catiónico : la relación de carga de oligonucléotido CpG varía de 8:1 a 1:2.

2. El complejo microparticulado inmunoestimulatorio de la reivindicación 1, en donde el inmunógeno de péptido catiónico es una mezcla de inmunógenos de péptido sintéticos.

3. El complejo microparticulado inmunoestimulatorio de la reivindicación 1, en donde la carga positiva neta del inmunógeno de péptido sintético catiónico es por lo menos +2.

4. El complejo microparticulado inmunoestimulatorio de la reivindicación 2, en donde la carga positiva neta promedio de la mezcla de inmunógenos de péptido sintéticos es por lo menos +2.

5. El complejo microparticulado inmunoestimulatorio de la reivindicación 3 o 4, en donde la carga negativa neta del oligonucleótido aniónico es por lo menos -2.

6. El complejo microparticulado inmunoestimulatorio de la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido CpG es una molécula de ADN de hebra sencilla co.

18. 48 bases de nucleótido y el número de repeticiones del motivo CpG allí en el rango de 3 a 8.

7. El complejo microparticulado inmunoestimulatorio de la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido CpG tiene la fórmula: 5' X1CGX2 3' en donde C y G no son metilados; y X1 se selecciona del grupo que consiste de A (adenina) , G (guanina) y T (timina) ; y X2 es C (citosina) o T (timina) .

8. El complejo microparticulado inmunoestimulatorio de la reivindicación 1, en donde el oligonucleótido CpG se

selecciona de un grupo que consiste de 5' TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT TTG TCG TT 3' (CpG1) SEQ ID NO: 1, un oligómero de longitud base 32, y 5'nTC GTC GTT TTG TCG TTT TGT CGT T 3' (CpG2) SEQ ID NO: 2, un oligómero de longitud base 24 más un grupo fosforotioato designado como n.

9. El complejo microparticulado inmunoestimulatorio de la reivindicación 8, en donde el oligonucleótido CpG es 5' TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT TTG TCG TT 3' (CpG1) SEQ ID NO: 1.

10. El complejo microparticulado inmunoestimulatorio de la reivindicación 8, en donde el inmunógeno de péptido catiónico es un péptido sintético conjugado con un epítopo de célula cooperador T.

11. El complejo microparticulado inmunoestimulatorio de la reivindicación 10, en donde el inmunógeno de péptido catiónico se selecciona del grupo que consiste de SEQ ID NO: 7, 8 y 9 y una mezcla de los mismos.

12. El complejo microparticulado inmunoestimulatorio de la reivindicación 1, en donde el inmunógeno de péptido catiónico: la relación de carga de oligonucléotido CpG varía de 4:1 a 1:1.

13. Un proceso para preparar un complejo inmunoestimulador estabilizado de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende las etapas de:

(a) disolver o dispersar el inmunógeno de péptido catiónico en una fase acuosa seleccionada del grupo que consiste de agua desionizada destilada, solución salina, PBS y una mezcla de los mismos con la condición que el pH de la fase acuosa es menor que el punto de ionización del inmunógeno de péptido;

(b) disolver el oligonucleótido CpG aniónico en una fase acuosa seleccionada del grupo que consiste de agua desionizada destilada, solución salina, PBS y una mezcla de los mismos;

(c) agregar el oligonucleótido CpG en la fase acuosa en forma de gotas a la solución o dispersión del inmunógeno de péptido catiónico en una cantidad para formar un complejo inmunoestimulador estabilizado del inmunógeno de péptido y el oligonucleótido CpG en una relación de carga del inmunógeno de péptido catiónico al oligonucleótido CpG en el rango de 16:1 a 1:1.

14. El proceso de la reivindicación 13, que comprende adicionalmente la etapa de retirar la fase acuosa de la suspensión del complejo inmunoestimulador obtenido.

15. El proceso de la reivindicación 14, en donde la fase acuosa se retira mediante liofilización, o secado por rociado.

16. El proceso de la reivindicación 13, en donde el complejo inmunoestimulador tiene un tamaño de partícula promedio en el rango de 1 a 50 µM.

17. El proceso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la cantidad del inmunógeno de péptido y el oligonucleótido CpG agregado está en una relación de carga en el rango de 16:1 del inmunógeno de péptido catiónico al nucleótido CpG.

18. El proceso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la cantidad del inmunógeno de péptido y el oligonucleótido CpG agregado está en una relación de carga en el rango de 16:1 del inmunógeno de péptido catiónico al nucleótido CpG.

19. El proceso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la cantidad del inmunógeno de péptido y el oligonucleótido CpG agregado está en una relación de carga en el rango de 4:1 del inmunógeno de péptido catiónico al nucleótido CpG.

20. El proceso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la cantidad del inmunógeno de péptido y el oligonucleótido CpG agregado está en una relación de carga en el rango de 4:1 del inmunógeno de péptido catiónico al nucleótido CpG.

21. El proceso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la cantidad del inmunógeno de péptido y el oligonucleótido CpG agregado está en una relación de carga en el rango de 2:1 del inmunógeno de péptido catiónico al nucleótido CpG.

22. El proceso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la cantidad del inmunógeno de péptido y el oligonucleótido CpG agregado está en una relación de carga en el rango de 2:1 del inmunógeno de péptido catiónico al nucleótido CpG.

23. El proceso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la cantidad del inmunógeno de péptido y el oligonucleótido CpG agregado está en una relación de carga en el rango de 1.5:1 del inmunógeno de péptido catiónico al nucleótido CpG.

24. El proceso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la cantidad del inmunógeno de péptido y el oligonucleótido CpG agregado está en una relación de carga en el rango de 1.5:1 del inmunógeno de péptido catiónico al nucleótido CpG.

25. El proceso de acuerdo con la reivindicación 13, en donde la cantidad del inmunógeno de péptido y el oligonucleótido CpG agregado está en una relación de carga en el rango de 1:1 del inmunógeno de péptido catiónico al nucleótido CpG.

26. El proceso de acuerdo con la reivindicación 14, en donde la cantidad del inmunógeno de péptido y el oligonucleótido CpG agregado está en una relación de carga en el rango de 1:1 del inmunógeno de péptido catiónico al nucleótido CpG.

27. Un proceso para preparar una emulsión agua en aceite que comprende un complejo inmunoestimulador de la reivindicación 1, que comprende las etapas de:

(a) preparar un complejo inmunoestimulador en fase acuosa seleccionada del grupo que consiste de agua desionizada destilada, solución salina y solución salina regulada con fosfato;

(b) agregar el complejo inmunoestimulador en la fase acuosa en una fase de aceite continúa seleccionada del grupo que consiste de un aceite sintético, un aceite vegetal, un aceite mineral, un aceite de animal metabolizable y una mezcla de los mismos;

(c) dispersar bajo corte mecánico el complejo inmunoestimulador en la fase acuosa en una fase de aceite continua para formar una emulsión agua en aceite homogénea

28. Un proceso para preparar a emulsión agua en aceite de acuerdo con la reivindicación 27, en donde la etapa (c) comprende:

(a) cargar una primera jeringa con la fase acuosa que contiene un complejo inmunoestimulador;

(b) cargar una segunda jeringa con la fase de aceite que tiene una viscosidad inherente de menos de 1, 500 mPa;

(c) conectar la primera y segunda jeringas a través de un tubo con orificio angosto a un soporte de membrana que aloja una membrana de tamaño de poro controlado 0.05-20 mM;

(d) extrudir la fase acuosa en la fase de aceite mediante intercambios repetidos a través de la membrana hasta que se forma la emulsión w/o homogénea.

29. El proceso de la reivindicación 27, en donde la fase de aceite se selecciona del grupo que consiste de un aceite metabolizable o no metabolizable seleccionado del grupo que consiste de Montanide® ISA 720, Montanide® ISA 51, Montanide® ISA 50v o una mezcla de los mismos.

30. El proceso de la reivindicación 28, en donde la fase de aceite se selecciona del grupo que consiste de un aceite metabolizable o no metabolizable seleccionado del grupo que consiste de Montanide® ISA 720, Montanide® ISA 51, Montanide® ISA 50v o una mezcla de los mismos.

31. El proceso de la reivindicación 27, en donde la fase acuosa puede comprender adicionalmente un tensoactivo, un estabilizante de emulsión, o una combinación de los mismos.

32. El proceso de la reivindicación 28, en donde la fase acuosa puede comprender adicionalmente un tensoactivo, un estabilizante de emulsión, o una combinación de los mismos.

33. El proceso de la reivindicación 31, en donde el estabilizante de emulsión se selecciona del grupo que consiste de un mannida-oleato y un derivado de los mismos.

34. El proceso de la reivindicación 32, en donde el estabilizante de emulsión se selecciona del grupo que consiste de un mannida-oleato y un derivado de los mismos.

35. El proceso de la reivindicación 27, en donde la fase de aceite comprende adicionalmente un adyuvante seleccionado del grupo que consiste de MPL, MDP, DDA, Avridina, BAY-1005, DC-Chol, Murapalmitina y un derivado de los mismos.

36. El proceso de la reivindicación 28, en donde la fase de aceite comprende adicionalmente un adyuvante seleccionado del grupo que consiste de MPL, MDP, DDA, Avridina, BAY-1005, DC-Chol, Murapalmitina y un derivado de los mismos.

37. El proceso de la reivindicación 27, en donde la fase acuosa comprende adicionalmente un adyuvante soluble acuoso seleccionado del grupo que consiste de PCPP, una saponina, una Toxina del Cólera, una Enterotoxina lábil al calor de E. Coli y una citoquina, seleccionada del grupo que consiste de IL-1ß, IL-2, IL-12, IFN-γ y un derivado de los mismos.

38. El proceso de la reivindicación 37, en donde el derivado de citoquina es un fragmento de péptido derivado de IL1ß, SEQ ID NO: 14.

39. El proceso de la reivindicación 28, en donde la fase acuosa comprende adicionalmente un adyuvante soluble acuoso seleccionado del grupo que consiste de PCPP, una saponina, una Toxina del Cólera, una Enterotoxina lábil al calor de E. Coli y una citoquina seleccionada del grupo que consiste de IL-1ß, IL-2, IL-12, IFN-γ y un derivado de los mismos.

40. El proceso de la reivindicación 39, en donde el derivado de citoquina es el fragmento de péptido derivado de IL1ß, SEQ ID NO: 14.

41. Un proceso de la reivindicación 14 que comprende adicionalmente las etapas:

(a) preparar una solución de un polímero gelificante in situ seleccionado del grupo que consiste de copolímero poliD, L-lacturocoglicolida, copolímero de ácido poli-D, L-láctico-ácido co-glicólico, policaprolactona, polianhídrido, poliortoéster, y poli (ácido α-hidroxibutírico) en un solvente biocompatible seleccionado del grupo que consiste de dimetil sulfóxido (DMSO) , N-metil pirrolidina (NMP) , triacetina y glicerina;

(b) reconstituir el complejo inmunoestimulador en forma seca en la solución del polímero gelificante in situ en el solvente biocompatible.

42. El proceso de la reivindicación 41, en donde en la etapa (b) el complejo inmunoestimulador en forma seca utilizado se obtiene mediante liofilización.

43. El proceso de la reivindicación 41 en donde el polímero biodegradable es

R1= OAlquilo (PLG) o OH (PLGA) R2= H en donde R1 es OH o alcoxi que tiene 1 a 5 carbonos y R2 es H; x:y es la relación de cada unidad de monómero del copolímero con x+y = 1.

44. El proceso de la reivindicación 42, en donde dicho polímero biodegradable es R1= OAlquilo (PLG) o OH (PLGA)

R2= H

En donde R1 es OH o alcoxi que tiene 1 a 5 carbonos y R2 es H; x:y es la relación de cada unidad de monómero del copolímero con x+y = 1.

45. El proceso de la reivindicación 43, en donde el copolímero tiene un peso molecular en el rango de 2, 000100, 000 daltons y una viscosidad inherente de 0.1-1.0 dl/g.

46. El proceso de la reivindicación 44, en donde el copolímero tiene un peso molecular en el rango de 2, 000100, 000 daltons y una viscosidad inherente de 0.1-1.0 dl/g.

47. El proceso de la reivindicación 41, en donde el peso del polímero gelificante in situ biodegradable disuelto en el solvente biocompatible está en el rango de 5 p/p % a 50 p/p%.

48. El proceso de la reivindicación 42, en donde el peso del polímero gelificante in situ biodegradable disuelto en el solvente biocompatible está en el rango de 5 p/p % a 50 p/p%.

49. El proceso de la reivindicación 41, en donde la etapa (c) comprende adicionalmente disolver un adyuvante soluble en aceite seleccionado del grupo que consiste de 3-O-desacil-4'-monofosforil de lípido A (MPL) , N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutamina (MDP) , Bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA) , N, N-dioctadecil-N', N'-bis (2hidroxietil) propanodiamina (Avridina) , hidroacetato N- (2-Desoxi-2-1-leucilamino-β-D-glucopiranosil) -N-octadecildodecanoilamida (BAY- 1005) , 3β-[N- (N, N'-dimetilaminoetano) -carbamoil] colesterol (DC-Chol) , NAc-Mur-L-Thr-DisoGln-sn-glicerol dipalmitoil (Murapalmitina) y una citoquina seleccionada del grupo que consiste de IL-1ß, IL-2, IL12, IFN-γ y un derivado de los mismos en el solvente biocompatible.

50. El proceso de la reivindicación 42, en donde la etapa (c) comprende adicionalmente disolver un adyuvante soluble en aceite seleccionado del grupo que consiste de 3-O-desacil-4'-monofosforil de lípido A (MPL) , N-acetil

muramil-L-alanil-D-isoglutamina (MDP) , Bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA) , N, N-dioctadecil-N', N'-bis (2hidroxietil) propanodiamina (Avridina) , hidroacetato N- (2-Desoxi-2-1-leucilamino-β-D-glucopiranosil) -N-octadecildodecanoilamida (BAY- 1005) , 3β -[N- (N, N'-dimetilaminoetano) -carbamoil] colesterol (DC-Chol) , NAc-Mur-L-Thr-DisoGln-sn-glicerol dipalmitoil (Murapalmitina) y una citoquina seleccionada del grupo que consiste de IL-1ß, IL-2, IL12, IFN-γ y mezclas y derivados de los mismos en el solvente biocompatible.

51. Un proceso para preparar una suspensión que comprende un complejo inmunoestimulador que comprende las etapas de:

(a) preparar un complejo inmunoestimulador de la reivindicación 1 en una fase acuosa seleccionada del grupo que consiste de agua desionizada destilada, solución salina y solución salina regulada con fosfato;

(b) preparar una suspensión de una sal mineral seleccionada del grupo que consiste de hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, y fosfato de calcio, en una fase acuosa seleccionada del grupo que consiste de agua desionizada destilada, solución salina y solución salina regulada con fosfato;

(c) agregar el complejo inmunoestimulador en la fase acuosa en una fase acuosa que contiene la suspensión de sal mineral;

(d) mezclar el complejo inmunoestimulador con la suspensión de sal mineral para formar una suspensión mezclada.

52. Un proceso para preparar una suspensión que comprende un complejo inmunoestimulador que comprende las etapas de:

(a) preparar una solución de un inmunógeno de péptido seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 3-13 en una fase acuosa seleccionada del grupo que consiste de agua desionizada destilada, solución salina y solución salina regulada con fosfato;

(b) preparar una suspensión de una sal mineral seleccionada del grupo que consiste de hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio y fosfato de calcio en una fase acuosa seleccionada del grupo que consiste de agua desionizada destilada, solución salina y solución salina regulada con fosfato;

(c) agregar la solución de péptido a la suspensión de la sal mineral con mezcla;

(d) agregar un nucleótido CpG seleccionado del grupo que consiste de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 2 con mezcla para formar una suspensión mezclada de un complejo inmunoestimulador y una sal mineral.

53. El proceso de la reivindicación 51, en donde la sal mineral se selecciona del grupo que consiste de fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio y una mezcla de los mismos.

54. El proceso de la reivindicación 52, en donde la sal mineral se selecciona del grupo que consiste de fosfato de aluminio, hidróxido de aluminio y una mezcla de los mismos.

55. El proceso de la reivindicación 51, en donde la fase acuosa puede comprender adicionalmente un tensoactivo, un tonificante, un conservante o cualquier combinación de los mismos.

56. El proceso de la reivindicación 52, en donde la fase acuosa puede comprender adicionalmente un tensoactivo, un tonificante, un conservante o cualquier combinación de los mismos.

57. El proceso de la reivindicación 55, en donde la fase acuosa comprende un tonificante seleccionada del grupo que consiste de PBS o solución salina y una mezcla de los mismos.

58. El proceso de la reivindicación 56, en donde la fase acuosa comprende un tonificante seleccionada del grupo que consiste de PBS o solución salina y una mezcla de los mismos.

59. El proceso de la reivindicación 55 que comprende adicionalmente agregar a la fase acuosa un conservante seleccionado del grupo que consiste de 2-fenoxi-etanol y un derivado de los mismos.

60. El proceso de la reivindicación 56 que comprende adicionalmente agregar a la fase acuosa un conservante seleccionado del grupo que consiste de 2-fenoxi-etanol y un derivado de los mismos.

61. El proceso de la reivindicación 51 que comprende adicionalmente agregar a la fase acuosa un adyuvante seleccionado del grupo que consiste de MPL, MDP, DDA, Avridina, BAY-1005, DC-Chol, Murapalmitina, PCPP, una

saponina, una Toxina del Cólera, una Enterotoxina lábil al calor de E. Coli y una citoquina seleccionada del grupo que consiste de IL-15, IL-2, IL-12, IFN-γ y un derivado de los mismos.

62. El proceso de la reivindicación 52 que comprende adicionalmente agregar a la fase acuosa un adyuvante seleccionado del grupo que consiste de MPL, MDP, DDA, Avridina, BAY-1005, DC-Chol, Murapalmitina, PCPP, una saponina, una Toxina del Cólera, una Enterotoxina lábil al calor de E. Coli y una citoquina seleccionada del grupo que consiste de IL-18, IL-2, IL-12, IFN-γ y un derivado de los mismos.

63. Una composición farmacéutica que comprende una suspensión de un complejo inmunoestimulador de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en un solvente acuoso seleccionado del grupo que consiste de agua desionizada destilada, solución salina y solución salina regulada con fosfato.

64. Una composición farmacéutica que comprende a emulsión agua en aceite de un complejo inmunoestimulador de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

65. Una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 63 que comprende adicionalmente un adyuvante seleccionado del grupo que consiste de MPL, MDP, DDA, Avridina, BAY-1005, DC-Chol, Murapalmitina, PCPP, una saponina, una Toxina del Cólera, una Enterotoxina lábil al calor de E. Coli y una citoquina seleccionada del grupo que consiste de IL-1ß, IL-2, IL-12, IFN-γ y un derivado de los mismos.

66. Una composición farmacéutica que comprende un gel de un complejo inmunoestimulador de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en donde el gel se forma in situ al agregar el complejo inmunoestimulador en forma seca a una solución de un polímero biocompatible gelificante in situ seleccionado del grupo que consiste de copolímero poli-D, L-lacturo-coglicolida, copolímero de ácido poli-D, L-láctico-ácido co-glicólico, policaprolactona, polianhídrido, poliortoéster, y poli (ácido α-hidroxibutírico) en un solvente biocompatible seleccionado del grupo que consiste de dimetil sulfóxido (DMSO) , N-metil pirrolidina (NMP) , triacetina y glicerina.

67. La composición farmacéutica de la reivindicación 66, en donde el polímero biodegradable es

R1= OAlquilo (PLG) o OH (PLGA) R2= H en donde R1 es OH o alcoxi que tiene 1 a 5 carbonos y R2 es H; x:y es la relación de cada unidad de monómero del copolímero con x+y = 1.

68. La composición farmacéutica de la reivindicación 67 en donde el polímero biodegradable tiene un peso molecular en el rango de 2, 000-100, 000 daltons y una viscosidad inherente de 0.1-1.0 dl/g.

69. Una composición farmacéutica que comprende una suspensión acuosa de una sal mineral y un complejo inmunoestimulador de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en donde la sal mineral se selecciona del grupo que consiste de hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, sulfato de aluminio, fosfato de calcio.

70. La composición farmacéutica de la reivindicación 69, en donde la fase acuosa se selecciona del grupo que consiste de agua desionizada destilada, solución salina, PBS y una mezcla de los mismos.

71. La composición farmacéutica de la reivindicación 69 que comprende adicionalmente un conservante seleccionado del grupo que consiste de 2-fenoxi-etanol y un derivado de los mismos en la fase acuosa.

72. Una composición de acuerdo con 63 para uso como una sustancia farmacéutica activa.

Figura 3Esquema de Proceso de Emulsión W/O por medio deHomogenización o Extrusión Fase Acuosa

Fase de Aceite

inmunógenos de péptido

Mineral o

Sintético

Complejo Inmunoestimulador Natural Emulsificante/Tensoactivo HomogenizaciónoExtrusión Gotas en FaseAcuosa Dispersa

Emulsión W/O

Fase en aceite Continua Títulos de Anticuerpo (log 10)

Figura 7 (Péptidos IgE/Complejos de CpG1 + Emulsiones W/O homogenizadas) 3 inmunizaciones (semana 0, 3, 6) , Hemorragias (semana 3, 5, 9, 11, 17)

Péptidos IgE/CpG1 Péptidos IgE +Péptidos IgE/CpG1 +

Emulsión Emulsión W/O

Títulos de Anticuerpo (log 10)

Figura 8

(Péptidos CD4/Complejos de CpG2 + Emulsiones W/O homogenizadas) 3 inmunizaciones (semana 0, 3, 6) , Hemorragias (semana 3, 5, 9, 11, 17)

Péptidos CD4/CpG2 Péptidos CD4+Péptidos CD4/CpG2 +Emulsión W/O Emulsión W/O

Títulos de Anticuerpo (log 10)

Figura 9 (Péptidos IgE/Complejos de CpG1 + Emulsiones W/O Extrudidas) 3 inmunizaciones (semana 0, 3, 6) , Hemorragias (semana 3, 5, 9, 11, 17)

Péptidos IgE/CpG1 Péptidos IgE +Péptidos IgE/CpG1 +Emulsión Emulsión W/O

Títulos de Anticuerpo (log 10)

Figura 11

(Péptidos IgE/Complejos de CpG1 + Geles PLGA/DMSOInmunización de Dosis Única, Hemorragias (semana 3, 6, 9, 12)

Péptidos IgE + Gel Péptidos IgE/CpG1 Péptidos IgE/CpG1 +

PLGA/DMSO

Gel PLGA/DMSO

Títulos de Anticuerpo (log 10)

Figura 12

(Péptidos CD4/Complejos de CpG2 + Geles PLGA/DMSOInmunización de Dosis Única, Hemorragias (semana 3, 6, 9, 12)

Péptidos CD4/CpG2 Péptidos CD4 + GelPéptidos CD4/CpG2 +PLGA/DMSO Gel PLGA/DMSO

Títulos de Anticuerpo (log 10)

Figura 13a

Péptidos LHRH/Complejos de CpG1 (4:1) + Sal Mineral3 inmunizaciones (semana 0, 4, 8) , Hemorragias (semana 0, 4, 6, 8, 12) en ratas

Péptidos LHRH LHRH/Alhidrogel LHRH/complejo CpG1LHRH/complejo CpG1

(4:1) (4:1) + Alhidrogel Niveles de Testosterona (nMol/L)

Figura 13b

Péptidos LHRH/Complejos de CpG1 (4:1) + Sal Mineral3 inmunizaciones (semana 0, 4, 8) , Hemorragias (semana 0, 4, 6, 8, 12) en ratas

Péptidos LHRH LHRH/complejo CpG1

LHRH/Alhidrogel Semanas Post Inyección (wpi)

Niveles de Testosterona (nMol/L)

Péptidos LHRH/Complejos de CpG1 (4:1) + Sal Mineral3 inmunizaciones (semana 0, 4, 8) , Hemorragias (semana 0, 4, 6, 8, 12) en babuinos

Babuino #1

Babuino #2

Alhidrogrel Babuino #1

Alhidrogrel Babuino #2

Semanas Post Inyección (wpi)

Figura 16

Esquema de un Complejo Inmunoestimulador y Suspensión de Sal Mineral Suspensión de Sal Mineral Complejo

Inmunógenos de Péptido

Inmunoestimulador Sintético no Unido Suspensión deSuspensión deInmunógenos deComplejoPéptido sintéticoInmunoestimulador Absorbidos porSal Mineral Inmunógenos de PéptidoSintético noUnido Residuales