Montaje genómico monocistrónico del virud de la hepatitis C (VHC) recombinante que comprende en orden de 5 'a3':

a) una región 5' no traducida del VHC, o una parte funcional de la misma;

b) un polinucleótido que comprende una secuencia de codificación para un fragmento del terminal N de laproteína nuclear JFH1, en el que dicho fragmento comprende al menos los primeros 12 restos y hasta los 18primeros restos de la proteína nuclear JFH1, en el que la secuencia de codificación para el terminal N delfragmento de la proteína nuclear JFH1 está ligada a un gen indicador;

c) una secuencia de codificación para una proteasa 2A del virus de la glosopeda (VFA);

d) una secuencia de codificación para un punto de escisión de la ubiquitina proteasa;

e) un polinucleótido que codifica una poliproteína del VHC que comprende el núcleo, las regiones, E1, E2 y

p7 de una estirpe o cepa del VHC aparte de JFH1, una región de NS2 híbrido que comprende una parte delterminal N de NS2 procedente de una estirpe o cepa de VHC distinto de JFH1 y una parte del terminal C deNS2 procedente de JFH1, y las regiones NS3, NS4a, NS4b, NS5a y de NS5b de JFH1; y

f) una región no traducida 3' del VHC o una parte funcional de la misma.

Sistema de cultivo de tejido para la producción de virus de la hepatitis C

Referencia cruzada con la solicitud relacionada

La presente solicitud reivindica el beneficio a tenor de bajo 35 U.S.C. § 119 (e) de la solicitud provisional 60/839, 608, presentada el 22 de agosto de 2006, cuya solicitud se incorpora por referencia en su totalidad.

Campo técnico

La invención se refiere a un sistema de cultivo de tejido para la producción de virus infeccioso de la hepatitis C.

Antecedentes

El virus de la hepatitis C (VHC) se identificó hace más de una década y se sabe actualmente que es la causa principal de la hepatitis vírica ni A ni B (Choo et al., Science (1989) 244:359-362; Armstrong et al., Hepatology (2000) 31:777) . El VHC infecta aproximadamente el 3% de la población mundial, unas 200 millones de personas estimadas (Cohen, J., Science (1999) 285:26) . Alrededor de 30.000 infecciones por VHC recién contraídas se producen anualmente en los Estados Unidos. Además, es muy frecuente la infección por VHC en los países desarrollados. Aunque la respuesta inmunitaria es que puede eliminar la infección por VHC, la mayoría de las infecciones se vuelven crónicas. La mayoría de las infecciones agudas continúan siendo asintomáticas y la hepatopatía suele producirse solamente tras años de infección crónica.

La secuencia genómica vírica del VHC es conocida, como lo son los procedimientos para obtener la secuencia. Véase, por ejemplo, las publicaciones internacionales n° WO 89/04669, n° WO 90/11089 y n° WO 90/14436. El VHC tiene un genoma de ARN monocatenario, de 9, 5 kb de sentido positivo y es un miembro de la familia de virus Flaviridae. Se han identificado por lo menos seis genotipos de VHC distintos, pero relacionados entre sí, basados en análisis filogenéticos (Simmonds et al., J. Gen. Virol . (1993) 74:2391-2399) . El virus codifica una única poliproteína que tiene aproximadamente 3000 restos de aminoácidos (Choo et al., Science (1989) 244:359362;. Choo et al., Proc Natl Acad Sci USA (1991) 88:2451-2455 ; Han et al., Proc Natl Acad Sci USA (1991) 88:17111715) .

En particular, el genoma del VHC codifica varias proteínas. El orden y la nomenclatura de los productos de escisión de la poliproteína del VHC es el siguiente: NH2-C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4a-NS4b-NS5a-NS5b-COOH. Se ha identificado también otra proteína (F) y procede del desplazamiento de marco en la traducción en el gen C. Branch et al., Semin. Liver Dis. (2005) 25:105-117. Las proteasas del hospedador catalizan la escisión inicial de la poliproteína las cuales liberan tres proteínas estructurales, la proteína de la nucleocápside en el terminal N (denominada núclear) y dos glucoproteínas de la envoltura, los gpE1 (también conocida como E) y gpE2 (también conocida como E2/NS1) , como así como proteínas no estructurales (NS) que codifican las enzimas víricas y otras actividades. Las regiones NS se denominan NS2, NS3, NS4 y NS5. NS2 es una proteína integral de la membrana con actividad proteolítica y, en combinación con NS3, escinde el enlace NS2-NS3. La proteasa NS3, junto con su cofactor NS4a, sirve para procesar la poliproteína restante. En estas reacciones, NS3 libera un cofactor de NS3 (NS4a) , dos proteínas (NS4b y NS5a) y una ARN polimerasa dependiente de ARN (NS5b) . La terminación de la maduración de la poliproteína se inicia mediante escisión autocatalítica en el enlace NS3-NS4a, catalizada por la serina proteasa NS3.

El desarrollo de fármacos antivíricos y vacunas contra la infección por VHC se ha visto obstaculizada por la falta de un modelo animal o sistema de cultivo celular adecuado para la multiplicación del VHC. Se ha encontrado que los VHC crecen muy poco en cultivo celular, y la utilización de replicones subgenómicos, que se multiplican de manera más eficaz en las células cultivadas, no ha logrado producir partículas víricas infecciosas (Bartenschlager et al. (2000) J. Gen. Virol. 81:1631 -1648;. Lohmann et al. (1999) Science 285:110-113; Ikeda et al. (2002) J. Virol. 76:2997-3006; Pietschmann et al. (2002) J. Virol. 76:4008-4021) . Además, se ha descubierto que los sistemas de multiplicación existentes son inadecuados para probar algunas estrategias antivíricas. Los sistemas de multiplicación a base de replicones subgenómicos automultiplicadores que sólo expresan proteínas víricas no estructurales no imitan todas las etapas del ciclo vital del virus VHC que pueden estar destinadas a la intervención antivírica. Las estirpes celulares que son transfectadas establemente con precursores de VHC, pero que son incapaces para la multiplicación del ARN del VHC, no se pueden utilizar para la detección de fármacos antivíricos que bloquean la multiplicación del ARN vírico. Recientemente, Pietschmann et al. demostraron que el virus infeccioso podría producirse a partir de un montaje genómico bicistrónico artificial de VHC en cultivo celular utilizando un montaje híbrido que comprende en un cistrón, secuencias procedente de la cepa JFH1 tipo 2a del VHa y secuencias de una segunda cepa de VHC, y en un cistrón separado, un gen indicador para seguimiento de la transcripción y de la infección (PNAS (2006) 103:7408-7413) .

Continúa habiendo necesidad, sin embargo, de mejorar los sistemas de cultivo de tejido para la producción de VHC y para el desarrollo de un sistema de cultivo de tejido que pueda producir de manera rentable y eficaz partículas infecciosas de VHC que puedan utilizarse en pruebas terapéuticas antivíricas.

Resumen de la invención

La presente invención se basa en el desarrollo de un sistema de cultivo celular fiable para la producción de partículas infecciosas de VHC. En concreto, la invención proporciona procedimientos de cultivo de virus VHC naturales e híbridos en células que pueden infectarse con VHC, tales como hepatocitos u otras células primarias o estirpes de células tumorales procedentes del hígado. Los procedimientos utilizan montajes genómicos recombinantes monocistrónicos y bicistrónicos para la producción de virus híbridos, incluyendo los montajes para la producción de la cepa JFH1 tipo 2a del VHC natural y montajes para la producción de virus híbridos que comprenden NS3 a NS5b y una parte en el terminal C de NS2 de la cepa JFH1, y el núcleo para P7 y una parte en el terminal N de NS2 de una segunda cepa de VHC (por ejemplo, H77C tipo 1a, Con1 tipo 1b o NZ1 o 452 tipo 3a) . Las montajes de la invención también puede incluir un gen indicador para facilitar la medición de la multiplicación del ARN y el poder infectante vírico en cultivos. El sistema de cultivo celular también puede incluir diversos factores que mejoran la multiplicación vírica o el poder infectante, tal como un supresor de silenciamiento de ARN (por ejemplo, polipéptido del virus NS1 de la gripe) para inhibir las vías de defensa del hospedador o CD81 para facilitar la introducción vírica en células hospedadoras. Además, se describe un ensayo de neutralización utilizando VHC cultivado en cultivo celular y se ha observado que los valores de neutralización determinados por este ensayo se correlacionan bien con la protección real de la infección por VHC en los animales vacunados.

Así, la presente invención está representada por las siguientes formas de realización, pero no se limitan a las mismas:

En un aspecto, la invención incluye un montaje genómico bicistrónico del VHC recombinante que comprende un primer cistrón que comprende una secuencia de codificación de un fragmento del terminal N de la proteína nuclear JFH1 que comprende al menos los 12 primeros restos y hasta los 18 primeros restos de la proteína nuclear JFH1, incluyendo cualquier número de restos entre ellos, tales como los restos 1-12, 1-13, 1-14, 1-15, 1-16, 1-17, 1-18 o de la proteína nuclear JFH1, en los que la secuencia de codificación del fragmento del terminal N de la proteína nuclear JFH1 está unida a un gen indicador y trasladada al marco con el mismo para generar un producto de fusión de un solo polipéptido. El gen indicador va seguido de un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES, por sus siglas en inglés) para la traducción de un segundo cistrón. El segundo cistrón comprende una secuencia de codificación de una poliproteína del VHC que comprende marcos de lectura abierta para el núcleo, regiones E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4a, NS4b, NS5a y NS5b, en las que la parte del terminal C de NS2 y las regiones NS3, NS4a, NS4b, NS5a y NS5b de la poliproteína del VHC proceden de JFH1 y del núcleo, regiones E1, E2 y p7, y la parte del terminal N de NS2 proceden de una segunda... [Seguir leyendo]

1. Montaje genómico monocistrónico del virud de la hepatitis C (VHC) recombinante que comprende en orden de 5 'a 3':

a) una región 5' no traducida del VHC, o una parte funcional de la misma; b) un polinucleótido que comprende una secuencia de codificación para un fragmento del terminal N de la proteína nuclear JFH1, en el que dicho fragmento comprende al menos los primeros 12 restos y hasta los 18 primeros restos de la proteína nuclear JFH1, en el que la secuencia de codificación para el terminal N del fragmento de la proteína nuclear JFH1 está ligada a un gen indicador; c) una secuencia de codificación para una proteasa 2A del virus de la glosopeda (VFA) ; d) una secuencia de codificación para un punto de escisión de la ubiquitina proteasa; e) un polinucleótido que codifica una poliproteína del VHC que comprende el núcleo, las regiones, E1, E2 y p7 de una estirpe o cepa del VHC aparte de JFH1, una región de NS2 híbrido que comprende una parte del terminal N de NS2 procedente de una estirpe o cepa de VHC distinto de JFH1 y una parte del terminal C de NS2 procedente de JFH1, y las regiones NS3, NS4a, NS4b, NS5a y de NS5b de JFH1; y

f) una región no traducida 3' del VHC o una parte funcional de la misma.

2. Montaje genómico de VHC recombinante de la reivindicación 1 que comprende un polinucleótido seleccionado del grupo que consiste en

a) un polinucleótido que comprende la secuencia contigua desde el nucleótido 7 hasta el nucleótido 10953 de la SEC. ID. nº 8; b) un polinucleótido que comprende la secuencia contigua desde el nucleótido 7 hasta el nucleótido 10953 de la SEC. ID. nº 9; c) un polinucleótido que comprende la secuencia contigua desde el nucleótido 7 hasta el nucleótido 10971 de la SEC. ID. nº 10; d) un polinucleótido que comprende la secuencia contigua desde el nucleótido 35 hasta el nucleótido 9723 de la SEC. ID. nº 16 e) un polinucleótido complementario de un polinucleótido de a) - d) , y

f) un producto de transcripción del ARN genómico del VHC de a) - e) .

3. Vector que comprende el montaje genómico del VHC recombinante de la reivindicación 1 o 2.

4. Producto de transcripción del ARN genómico del VHC, que comprende el montaje genómico del VHC recombinante de la reivindicación 1 o 2.

5. Sistema de cultivo de tejido para la producción de partículas infecciosas de VHC que comprende una célula capaz de apoyar la infección de VHC tranfectada con el producto de transcripción del ARN genómico del VHC de la reivindicación 4.

6. Sistema de cultivo de tejido de reivindicación 5, que comprende además un polinucleótido que codifica un supresor de silenciamiento de ARN o un polinucleótido que codifica un polipéptido CD81.

7. Procedimiento para producir VHC en cultivo de tejido, que comprende la transfección de una célula con el producto de transcripción del ARN genómico de VHC de reivindicación 4 y cultivar dicha célula en medio de cultivo en condiciones adecuadas para la multiplicación del montaje y la secreción de partículas víricas infecciosas en dicho medio de cultivo.

8. Procedimiento de reivindicación 7, que comprende además transfectar dicha célula con un polinucleótido que codifica un supresor de silenciamiento de ARN antes de transfectar la célula con el producto de transcripción del ARN genómico del VHC; o un polinucleótido que codifica un polipéptido CD81.

9. Virus quimérico de la hepatitis C que comprende el producto de transcripción del ARN genómico del VHC de la reivindicación 4 o producido por cualquiera de los procedimientos de las reivindicaciones 7 u 8.

10. Kit que comprende una célula capaz de apoyar la multiplicación del VHC y a) el vector de la reivindicación 3 o b) el producto de transcripción del ARN genómico del VHC de la reivindicación 4.

11. Kit de la reivindicación 10 que comprende el producto de transcripción del ARN genómico del VHC de la reivindicación 4, en el cual la célula es un hepatocito tranfectado con el producto de transcripción del ARN genómico

del VHC.

12. Kit de cualquiera de reivindicaciones 10 u 11, que comprende además un polinucleótido que codifica un supresor de silenciamiento de ARN.

13. Kit de la reivindicación 10 que comprende el producto de transcripción del ARN genómico del VHC de la reivindicación 4, que comprende además un polinucleótido que codifica un polipéptido CD81.

14. Procedimiento de identificación de un compuesto con actividad anti-VHC, procedimiento que comprende:

a) tratar el sistema de cultivo de tejido de la reivindicación 5 con un compuesto; b) comparar la multiplicación del VHC, la expresión de las proteínas del VHC o el poder infectante vírico en dicho sistema de cultivo tratado con dicho compuesto con dicho sistema de cultivo de tejido no tratado con dicho compuesto, en el que una reducción en el nivel de multiplicación del VHC, la expresión de proteínas del VHC o el poder infectante vírico en el sistema de cultivo de tejido tratado con dicho compuesto es indicativo de un compuesto con actividad anti-VHC.

15. Procedimiento de identificación de un anticuerpo con actividad anti-VHC, procedimiento que comprende:

a) tratar el sistema de cultivo de tejido de la reivindicación 5 con el anticuerpo; b) comparar la multiplicación del VHC, la expresión de proteínas del VHC o el poder infectante vírico en dicho sistema de cultivo tratado con dicho compuesto con dicho sistema de cultivo de tejido no tratado con el anticuerpo, en el que una reducción en el nivel de multiplicación del VHC, la expresión de proteínas del VHC o el poder infectante vírico en el sistema de cultivo de tejido tratado con dicho compuesto es indicativo de un anticuerpo con actividad anti-VHC.

16. Procedimiento para producir el VHC en cultivo de tejido, que comprende la transfección de una célula con el producto de transcripción del ARN genómico del VHC de reivindicación 4 y el cultivo de dicha célula en medios de cultivo en condiciones adecuadas para la multiplicación del producto de transcripción genómica de ARN del VHC y la secreción de partículas infecciosas víricas en dichos medios de cultivo, en el que la célula transfectada expresa CD81 y un polipéptido NS1 de la gripe.