Reducción del contenido de contaminantes proteínicos en composiciones que comprenden una proteína dependiente de la vitamina K de interés.

Un método para reducir el contenido de proteína S en una composición que comprende una proteína dependiente devitamina K recombinante de interés producida bajo condiciones de cultivo celular,

comprendiendo dicho métodosometer la composición a una combinación de las etapas A y B:

(A) poner en contacto dicha composición que comprende una proteína dependiente de vitamina K de interésproducida bajo condiciones de cultivo celular con un material en fase sólida que tiene anticuerposmonoclonales contra la proteína dependiente de vitamina K de interés, la cual es capaz de enlazar a la proteínade dependiente de vitamina K de interés y recolectar una segunda composición resultante que comprende laproteína de interés dependiente de vitamina K; y

(B) poner en contacto una composición que ha sido sometida a la etapa (A) con un material en fase sólidaque tiene anticuerpos monoclonales contra la proteína S, que es capaz de enlazar la proteína S mientras laproteína dependiente de vitamina K de interés no se enlaza a la fase sólida y fluye a través de la columnacromatográfica; y recolectar una composición resultante que comprende la proteína de interés dependiente devitamina K;

donde la composición que comprende una proteína dependiente de vitamina K de interés producida bajocondiciones de cultivo celular es un sobrenadante de cultivo celular y donde dicho sobrenadante de cultivocelular se aplica al material en fase sólida del paso (A) sin pasos de purificación previos,donde la concentración de proteína S, expresada como partes por millón en relación a la proteína de interésdependiente de vitamina K ha sido reducida de dicho sobrenadante de cultivo celular para la composiciónresultante de la etapa (B) en por lo menos un factor de 2.

Reducción del contenido de contaminantes proteínicos en composiciones que comprenden una proteína dependiente de la vitamina K de interés CAMPO DE LA INVENCION

La presente invención se refiere a composiciones de proteínas dependientes de la Vitamina K que tienen un contenido muy bajo, o insignificante, de contaminantes proteínicos. La presente invención se refiere a métodos aplicables en la preparación de estas composiciones de proteínas dependientes de la Vitamina K. En particular, los métodos de la invención son para reducir el contenido de Proteína S en una composición formada por una proteína recombinante dependiente de la Vitamina K de interés producida bajo condiciones de cultivo celular. Estos métodos se pueden utilizar ya sea solos o en combinación secuencial con el propósito de reducir el contenido relativo de contaminantes proteínicos. La presente invención es particularmente relevante en la preparación de composiciones de factores de coagulación seleccionados de los polipéptidos del Factor X (FX/FXa) , polipéptidos del Factor IX (FIX/FIXa) , polipéptidos del Factor VII (FVII/FVIIa) y la Proteína C anticoagulante, en particular los polipéptidos del Factor VII.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

En la producción de proteínas recombinantes a partir de cultivos de microorganismos o líneas de células, el paso de producción final es la recuperación y opcionalmente la concentración del producto de interés. Los medios de cultivo en los cuales se han desarrollado las células y los cuales contienen proteínas secretadas y, en particular, lisados de células que contienen proteínas intracelulares de interés también contienen, a un grado mayor o menor, otras proteínas producidas por las células, además de otros contaminantes, tales como componentes de medios, ácidos nucleicos y similares. A fin de obtener un producto proteínico purificado, por lo tanto es necesario separar la proteína de interés de otras proteínas y polipéptidos y otras impurezas en el material crudo que contiene la proteína de interés.

Frecuentemente es difícil retirar el contaminante proteínico que comprende dominios del mismo carácter que el polipéptido de interés.

Las proteínas dependientes de la vitamina K se distinguen de otras proteínas al compartir una característica estructural común en su parte terminal amino de la molécula. La terminal N de estas proteínas, también referida como el dominio Gla, es rica en el aminoácido inusual ácido γ-carboxiglutámico el cual es sintetizado a partir de glutamato en una reacción dependiente de la vitamina K catalizada por la enzima γ-glutamilcarboxilasa. Debido a la presencia de aproximadamente 2 a 12 residuos de Gla, el dominio Gla está caracterizado por ser capaz de enlazar cationes divalentes tales como Ca2+ . Con el enlace de los iones metálicos, estas proteínas se someten a cambios conformacionales los cuales pueden medirse por medio de varias técnicas tal como el dicroísmo circular y la emisión de fluorescencia.

El descubrimiento de cambios conformacionales inducidos por metales de proteínas que contienen Gla (Nelsestuen et al., J. Biol. Chem. 1976; 251, 6886-6893) junto con la identificación de anticuerpos policlonales específicos para la conformación (Furie et al., J. Biol. Chem. 1978; 253, 8980-8987) abrió la puerta para la introducción de la cromatografía de inmunoafinidad específica para la conformación. Estos anticuerpos pudieron reconocer y unirse al dominio Gla en presencia de iones Ca2+ pero liberaron la proteína con la remoción de los iones Ca2++ utilizando un quelador tal como EDTA o citrato.

En la década de 1980, la cromatografía de pseudoafinidad específica para la conformación se desarrolló haciendo uso de la propiedad única de las proteínas que contenían Gla para someterse a cambios inducidos por metales en la conformación. La cromatografía de pseudoafinidad difiere de la cromatografía de afinidad convencional debido a que no existe un ligando de afinidad inmovilizado que esté implicado y se realiza sobre una matriz cromatográfica convencional (Yan S. B., J. Mol. Recog. 1996; 9, 211-218) . La proteína Gla puede ser absorbida en un material de intercambio aniónico al eliminar los iones metálicos divalentes. Posteriormente, la elución se realiza al agregar Ca2++ al tampón de elución.

En 1986, Bjørn y Thim reportaron la purificación del Factor VII recombinante en un material de intercambio aniónico tomando ventaja de la propiedad de enlaces de Ca2+ del dominio Gla del Factor VII (Bjørn S. y Thim L., Research Dislosure, 1986, 26960-26962.) . La absorción se logró en un tampón sin Ca2+ y la elución del Factor VII fue posible utilizando un tampón que contenía Ca2 + con una baja intensidad iónica y bajo condiciones suaves.

Yan et al. han utilizado el mismo principio para la purificación de la Proteína C humana recombinante (Yan S. B. et al., Bio/technology. 1990; 8, 655-661) .

Mientras que la presencia del dominio Gla proporciona una ventaja para la separación de proteínas que contienen Gla de otras proteínas, los inventores de la presente invención observaron que propiedades similares y el comportamiento de las proteínas que contienen Gla hace difícil separarlas unas de las otras. Varios anticuerpos específicos conformacionales producidos contra unas proteínas Gla muestran reactividad cruzada con otras proteínas Gla (Furie B. y Furie B., J. Biol. Chem. 1979; 254, 9766-9771; Church et al., J. Biol. Chem. 1988; 263, 6259-6267) .

Brown et al. (Brown et al., J. Biol. Chem. 2000; 275, 19795-19802.) han reportado anticuerpos monoclonales que son específicos para los residuos Gla. Estos anticuerpos podrían reconocer todas las proteínas Gla sometidas a prueba: Factor VII, Factor IX, Factor II, Proteína C, Proteína S, GAS-6, proteína Gla de matriz ósea, conantocina G.

Las proteínas con un dominio GLA comprenden, pero no están limitadas a, las siguientes proteínas: GAS-6, Proteína S, Factor II (Protrombina) , trombina, Factor X/Xa, Factor IX/IXa, Proteína C, Factor VII/VIIa, Proteína Z, proteína 1 de ácido gamma-carboxiglutámico transmembrana, proteína 2 de ácido gamma-carboxiglutámico transmembrana, proteína 3 de ácido gamma-carboxiglutámico transmembrana, proteína 4 de ácido gammacarboxiglutámico transmembrana, proteína Gla de Matriz y Osteocalcina.

El documento US 5, 633, 350 describe un método para la separación de proteínas dependientes de la vitamina K a partir de proteínas complementarias no dependientes de la vitamina K.

La necesidad de separar eficientemente una proteína dependiente de la Vitamina K de interés, tal como un polipéptido que contiene el dominio Gla de interés, a partir de contaminantes proteínicos es un problema particularmente relevante cuando se trata de la purificación de estos polipéptidos producidos en cultivos celulares, debido a que la célula huésped (la cual puede no ser una línea de células humana) puede producir cantidades significativas de contaminantes proteínicos que pueden causar reacciones inmunogénicas indeseables con el uso del polipéptido.

De esta manera, un objetivo de la presente invención es proporcionar métodos adecuados para la reducción o incluso la eliminación del contenido de contaminantes proteínicos en composiciones que comprendan una proteína dependiente de la vitamina K de interés. Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar composiciones que comprendan una proteína dependiente de la vitamina K de interés con un contenido muy bajo o aún insignificante de contaminantes proteínicos.

DESCRIPCION DE LA INVENCION

La invención se refiere a varios métodos para reducir o incluso eliminar el contenido de Proteína S en composiciones que comprenden una proteína dependiente de la vitamina K de interés.

Proteínas dependientes de la vitamina K de interés [0016] La presente invención se refiere en un amplio aspecto a la purificación de una proteína dependiente de la vitamina K de interés y composiciones descritas aquí como purificadas que comprenden estas proteínas. El término “de interés” se aplica en este documento como un indicador a la especie particular (una proteína dependiente de la vitamina K) la cual es relevante para la obtención en la forma más pura, por ejemplo con el propósito de utilizar la proteína dependiente de la vitamina K en un contexto terapéutico.

Los métodos descritos en este documento pueden ser aplicables en principio a la purificación de cualquier proteína dependiente de la vitamina K que comprenda, pero que no está limitada a, GAS-6, Proteína S, Factor II (Protrombina) , Trombina, Factor X/Xa, Factor IX/IXa, Proteína C, Factor... [Seguir leyendo]

1. Un método para reducir el contenido de proteína S en una composición que comprende una proteína dependiente de vitamina K recombinante de interés producida bajo condiciones de cultivo celular, comprendiendo dicho método someter la composición a una combinación de las etapas A y B:

(A) poner en contacto dicha composición que comprende una proteína dependiente de vitamina K de interés producida bajo condiciones de cultivo celular con un material en fase sólida que tiene anticuerpos monoclonales contra la proteína dependiente de vitamina K de interés, la cual es capaz de enlazar a la proteína de dependiente de vitamina K de interés y recolectar una segunda composición resultante que comprende la proteína de interés dependiente de vitamina K; y

(B) poner en contacto una composición que ha sido sometida a la etapa (A) con un material en fase sólida que tiene anticuerpos monoclonales contra la proteína S, que es capaz de enlazar la proteína S mientras la proteína dependiente de vitamina K de interés no se enlaza a la fase sólida y fluye a través de la columna cromatográfica; y recolectar una composición resultante que comprende la proteína de interés dependiente de vitamina K; donde la composición que comprende una proteína dependiente de vitamina K de interés producida bajo condiciones de cultivo celular es un sobrenadante de cultivo celular y donde dicho sobrenadante de cultivo celular se aplica al material en fase sólida del paso (A) sin pasos de purificación previos, donde la concentración de proteína S, expresada como partes por millón en relación a la proteína de interés dependiente de vitamina K ha sido reducida de dicho sobrenadante de cultivo celular para la composición resultante de la etapa (B) en por lo menos un factor de 2.

2. Método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el nivel de Proteína S expresado en partes por millón con relación a la proteína de interés dependiente de vitamina K se ha reducido de dicho sobrenadante de cultivo celular a la composición resultante de la etapa (B) por al menos un factor de 5.

3. Método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la proteína dependiente de vitamina K de interés es un polipéptido de Factor IX.

4. Método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la proteína dependiente de vitamina K de interés es un polipéptido de Factor X.

5. Método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque la proteína de interés dependiente de vitamina K es un polipéptido de Factor VII.

6. Método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque la proteína de interés dependiente de vitamina K es un polipéptido de Factor VIIa humano natural.

7. Método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el polipéptido de Factor VII comprende una sustitución de aminoácidos que se selecciona de P10Q y K32E.

8. Método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque dicha proteína S es una proteína S de hámster.

9. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque la concentración de proteína S, expresada como partes por millón en relación a la proteína de interés dependiente de vitamina K, ha sido reducida por lo menos en un factor de 10, o por lo menos en un factor de 25, o por lo menos en un factor de 50, tal como por lo menos un factor de 100, o por lo menos un factor de 250 o por lo menos un factor de 500 o por lo menos un factor de 750 o por lo menos un factor de 1000 o por lo menos un factor de 2000 o por lo menos un factor de 5000.

10. Método de conformidad con la reivindicación 1 o 2, caracterizado porque el contenido de uno o varios contaminantes de proteína S en el sobrenadante de cultivo celular no purificado es de por lo menos 500 ppm.

11. Método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque el contenido total de contaminantes de proteína en la composición purificada resultante que comprende proteína de interés dependiente de vitamina K es como máximo 100 ppm, o como máximo 50 ppm, o como máximo 10 ppm, o como máximo 5 ppm, o como máximo 2 ppm, o como máximo 1 ppm.