Una proteína quimérica que comprende la secuencia de aminoácidos de un agente de dirección hacia célulasespecíficas y la secuencia de aminoácidos de una proteína externa,

P, de Yersinia (YopP), conectadas por unpolipéptido que permite la translocación de la proteína quimérica o de uno de sus fragmentos, desde el endosomahasta el citosol de una célula diana, en la que el agente de dirección hacia células específicas es la parteextracelular de un receptor de TNF/NGF.

Proteínas quiméricas que comprenden Yersinia yop, su preparación y composiciones farmacéuticas que las contienen.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a una proteína quimérica que comprende un agente de dirección hacia células y una proteína externa de Yersinia, conectadas por un polipéptido de translocación. La invención se refiere, además, a la preparación y uso de tal proteína quimérica.

Antecedentes de la invención

Las citoquinas de la familia del factor de la necrosis tumoral (familia TNF) proporcionan un punto de vista único de regulación biológica. Estas citoquinas y sus receptores son expresados en casi todas las células y desencadenan una amplia gama de diferentes actividades celulares, en parte en oposición (Wallach et al., 1999. Locksley et al., 2001, y Wallach et al, 2000) . Estas citoquinas ayudan a regular prácticamente todos los aspectos de la defensa inmunitaria, así como ciertos procesos relacionados con el desarrollo. Todas estas actividades están mediadas por un único conjunto de proteínas de señalización, aparentemente pocas, que son compartidas por los diferentes receptores (Wallach et al., 1999) .

Las citoquinas sirven, normalmente, para intensificar la defensa. No obstante, cuando actúan en exceso, pueden ocasionar gran daño, comparable con el que pueden causar los patógenos. En efecto, en muchas enfermedades, los efectos injustificados de las citoquinas constituyen una causa patógena importante.

Las citoquinas de la familia TNF regulan una amplia gama de diferentes mecanismos de la defensa inmunitaria, tanto del tipo innato como del tipo adaptativo. La función excesiva de varias de ellas, con inclusión del TNF, el ligando Fas, el ligando CD40 y otros, ha sido implicada en la patología de diversas enfermedades. Existe, en particular, una evidencia extensa del papel patológico importante del TNF en una amplia variedad de enfermedades; enfermedades infecciosas tales como la malaria y la sepsis, enfermedades autoinmunitarias tales como la artritis reumatoide, las enfermedades intestinales inflamatorias y la psoriasis, y ciertos tipos de cáncer. Sin duda, se ha descubierto que el bloqueo de la acción del TNF por agentes tales como anticuerpos anti-TNF o receptores del TNF solubles, proporcionan terapia en tales situaciones (Beutler, 1999, Kollias et al., 1999 y Reinold, 2003) . En algunas situaciones patológicas, que incluyen la artritis reumatoide y la enfermedad de Crohn, una proporción bastante importante de los pacientes responden favorablemente a la terapia anti-TNF. Sin embargo, también existen pacientes con tales enfermedades que responden bastante pobremente a estos agentes, poniendo de manifiesto la necesidad de encontrar enfoques terapéuticos adicionales (Andreakos et al., 2002) .

A diferencia de muchas otras citoquinas que actúan únicamente como proteínas solubles después de su secreción por la célula que produce citoquinas, los ligandos de la familia TNF son producidos como proteínas transmembranales de tipo II unidas a las células (con la excepción de la linfotoxina que es producida como una proteína soluble secretada) . Estos ligandos pueden ejercer sus efectos de esta forma, afectando solamente a las células que están situadas adyacentes a las células que producen el ligando (regulación yustacrina) . La mayoría de ellos también son diseminados, formando moléculas solubles que circulan. Parte de esos ligandos solubles, por ejemplo el TNF, son capaces de actuar como citoquinas solubles, que sirven como reguladores paracrinos (que afectan a células situadas relativamente próximas a las células que producen el ligando) y reguladores endocrinos (que afectan a células remotas) . Algunos ligandos de la familia TNF, por ejemplo el ligando Fas, no actúan eficazmente en su forma desprendida y pueden servir, incluso en tal forma, como antagonistas de la forma unida a las células (Wallach et al., 1999, y Locksley et al., 2001) .

La presencia de ligandos de la familia TNF sobre la superficie de las células que los producen, proporciona medios potenciales para el impacto específico en las células que producen esos ligandos. Tales medios pueden permitir la muerte selectiva de las células que producen los ligandos en situaciones en las que el ligando desempeña un papel patogénico.

En varios aspectos, la destrucción de células que producen una citoquina puede volver a proporcionar incluso una mejor defensa contra los efectos patogénicos de esta citoquina, que el bloqueo directo de la función de las moléculas de citoquina. La destrucción de la célula que produce citoquina evita la síntesis posterior de las citoquinas y por tanto es probable que proporcione una protección más duradera que la obtenida bloqueando el efecto de las moléculas de citoquina que ya hayan sido sintetizadas,

Las células que producen una citoquina producen con frecuencia simultáneamente algunas otras citoquinas que en conjunto sirven para provocar un tipo particular de respuesta inmunitaria. Son ejemplos bien conocidos los linfocitos T de tipo Th1 y Th2, que producen grupos diferentes de citoquinas, cada una de las cuales sirve para provocar un tipo diferente de defensa inmunitaria (Jankovic et al., 2001) . La destrucción de las células que producen una citoquina puede, por tanto, además de detener la síntesis de tal citoquina particular, dar por resultado también la detención de la síntesis de otras diversas citoquinas que ayudan a las primeras en sus efectos patogénicos.

Si bien el bloqueo de las citoquinas en circulación afecta a la totalidad del cuerpo, la destrucción de las células que producen citoquinas o la atenuación de la producción de citoquinas puede ser restringida al lugar determinado del cuerpo en el que residen estas células, lo que permite de este modo la abolición de los efectos perjudiciales de las citoquinas en tal sitio particular, al tiempo que mantener los efectos beneficiosos de las citoquina en otros lugares.,

Estudios del efecto de la terapia anti-TNF en la enfermedad de Crohn, sugieren que la destrucción de las células que producen TNF puede proporcionar, sin duda., en algunos estados patológicos, una terapia más eficaz que la obtenida con el bloqueo del TNF. Se ha descubierto que los efectos terapéuticos de anticuerpos anti-TNF en esta enfermedad, se correlacionaban con la inducción precoz de muerte por los anticuerpos, de las células que producen TNF (Lugering et al., 2001, Van Deventer, 2001, y Van den Brande et al., 2003) .

El TNF-a es expresado por monocitos, macrófagos y células T CD8+, activados. Estas células presentan TNF-a fijado en la membrana como componente fundamental en su camino citolítico. En las enfermedades que siguen se sospecha que macrófagos activados están implicados en su patología: choque séptico, artritis reumatoide, espondilitis anquilosante y artritis psoriatica (Singh y Suruchi, 2004) , psoriasis (Asadullah et al., 2002) , esclerosis lateral amiotrófica (Ghezzi et al, 1998) , diabetes mellitus dependiente de insulina (Kagi et al., 1999) , enfermedad de injerto contra huésped (Hongo et al., 2004) , y anemia de células falciformes (Belcher et al., 2000) . En las enfermedades que siguen se sospecha que están involucradas en su patología células T CD8+: lupus eritematoso sistémico (Pacheco et al., 2002) , artritis reactiva y otras enfermedades autoinmunitarias (Mittler, 2004) . Con frecuencia, la célula T CD8+ activada es perjudicial para un órgano específico. Por ejemplo, la apoptosis hepatocítica extensa que ocurre durante la inflamación del hígado, es inducida después de la infiltración en el hígado de células T CD8+ activadas.

Moléculas quiméricas que comprenden una citotoxina ligada a una molécula de dirección que se une a un constituyente de la superficie celular, pueden servir como agentes potentes de muerte celular. La elección de un resto de dirección que reconozca un constituyente superficial específico de un tipo de células, puede permitir aplicar tales moléculas quiméricas citotóxicas a la destrucción selectiva de células específicas, in vivo. Por ejemplo, proteínas quiméricas de fusión que comprenden anticuerpos contra epítopos específicos del cáncer, fusionadas a exotoxina de Pseudomonas (PE) o a la toxina diftérica (DT) pueden dirigirse específicamente y matar células cancerosas. Tales efectos anticancerosos han sido obtenidos también con moléculas quiméricas en las que las toxinas han sido fusionadas a hormonas o a ligandos tales como IL-2, IL-4 ó IL-13, cuyos receptores son predominantes en ciertos... [Seguir leyendo]

1. Una proteína quimérica que comprende la secuencia de aminoácidos de un agente de dirección hacia células específicas y la secuencia de aminoácidos de una proteína externa, P, de Yersinia (YopP) , conectadas por un polipéptido que permite la translocación de la proteína quimérica o de uno de sus fragmentos, desde el endosoma hasta el citosol de una célula diana, en la que el agente de dirección hacia células específicas es la parte extracelular de un receptor de TNF/NGF.

2. La proteína quimérica según la reivindicación 1, en la que la parte extracelular de un receptor de TNF/NGF es la proteína 1 de unión a TNF (TBP-1) .

3. La proteína quimérica según la reivindicación 1, en la que la parte extracelular de un receptor de TNF/NGF es TBP-2

4. La proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que YopP posee actividad reducida o no apoptótica, y está seleccionada entre los serogrupos O: 3, O: 9 y O:8 de YopP, mutados en el resto de arginina-143.

5. La proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el polipéptido que permite la translocación incluye el dominio de translocación de la exotoxina de Pseudomonas o de uno de sus fragmentos.

6. La proteína quimérica según la reivindicación 1, en la que el fragmento del dominio de translocación de la exotoxina de Pseudomonas es deficiente en el dominio último (F) de la hélice a..

7. La proteína quimérica según la reivindicación 5, en la que el fragmento del dominio de translocación de la exotoxina de Pseudomonas, designado en esta memoria PEIItr, corresponde a la secuencia de aminoácidos de la exotoxina de Pseudomonas aeruginosa de la Fig. 3 (SEQ ID NO:3)

8. La proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende uno o dos sitios de escisión de furina.

9. La proteína quimérica según la reivindicación 8, en la que un sitio de escisión de furina esta situado en el extremo N-terminal del polipéptido que permite la translocación, y otro sitio de escisión de furina está situado en el extremo N-terminal de la proteína YopP.

10. La proteína quimérica según la reivindicación 8 ó 9, en la que un sitio de escisión de furina es el sitio de escisión de furina de la toxina diftérica.

11. La proteína quimérica según la reivindicación 10, en la que el sitio de escisión de furina posee la secuencia de aminoácidos RVRR, designado en esta memoria DT.

12. La proteína quimérica según la reivindicación 11, en la que la proteína quimérica consiste en TBP-1, el fragmento del dominio de translocación de la exotoxina de Pseudomonas aeruginosa PEIItr, el sitio de escisión de furina DT, y la proteína YopP, designada aquí TBP-YopP, o una muteína, variante, proteína de fusión, derivado funcional, fragmento o sal de la misma

13. La proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que la célula diana es una célula linfoide.

14. La proteína quimérica según la reivindicación 13, en la que la célula diana es un macrófago.

15. La proteína quimérica según la reivindicación 13, en la que la célula diana es un monocito.

16, . La proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que célula diana es una célula epitelial.

17. Una secuencia de DNA que codifica una proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a

16.

18. La secuencia de DNA según la reivindicación 17, que codifica, además, un péptido señal para secreción en células eucarióticas.

19. Un vector de expresión que comprende la secuencia de DNA según la reivindicación 17 ó 18.

20. El vector de expresión según la reivindicación 19, en el que el DNA está ligado funcionalmente a un promotor que posee una actividad que es independiente de NF-KB.

21. El vector de expresión según la reivindicación 20, en el que el promotor es EF-1a.

22. Una célula huésped que comprende un vector de expresión según una cualquiera de las reivindicaciones 19 a

21.

23. La célula huésped según la reivindicación 22, en la que la célula es una célula eucariótica seleccionada entre células HeLa, CHO, 293, de levadura y de insecto.

24. La célula huésped según la reivindicación 22, en la que la célula es una célula procariótica.

25. Un método para producir una proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, que comprende cultivar una célula huésped según una cualquiera de las reivindicaciones 22 a 24, y aislar la proteína quimérica producida.

26. El método según la reivindicación 25, en el que la proteína quimérica es TBP-YopP, o una muteína, variante, proteína de fusión o fragmento de la misma.

27. Una composición farmacéutica que comprende una proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1a 16, y un excipiente farmacéuticamente aceptable.

28. La composición farmacéutica según la reivindicación 27, en la que la proteína quimérica es TBP-YopP, o una muteína, variante, proteína de fusión, derivado funcional, fragmento o sal de la misma.

29. Uso de una proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, para fabricar un medicamento para el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre malaria, sepsis, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad intestinal inflamatoria y cáncer.

30. La proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1a 16, para usar en el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre malaria, sepsis, artritis reumatoide, psoriasis, enfermedad intestinal inflamatoria y cáncer.

31. El uso según la reivindicación 29 o la proteína quimérica según la reivindicación 30, en el que la proteína quimérica es TBP-YopP. o una muteína, variante, proteína de fusión derivado funcional, fragmento o sal de la misma.

32. Uso de una proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, para fabricar un medicamento para el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre choque séptico, artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, psoriasis, esclerosis lateral amiotrófica, diabetes mellitus dependiente de insulina, enfermedad de injerto contra huésped y anemia de células falciformes.

33. La proteína quimérica según una cualquiera de las reivindicaciones 1-15, para usar en el tratamiento de una enfermedad seleccionada entre choque séptico, artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, psoriasis, esclerosis lateral amiotrófica, diabetes mellitus dependiente de insulina, enfermedad de injerto contra huésped y anemia de células falciformes.

34. El uso según la reivindicación 12 o la proteína quimérica según la reivindicación 33, en el que la proteína quimérica. es TBP-YopP, o una muteína, variante, proteína de fusión, derivado funcional, fragmento o sal de la misma.

35. Un método in vitro para reducir la expresión anormal de un ligando sobre la superficie celular de una célula diana, que comprende exponer la célula a una proteína quimérica que comprende la parte extracelular de un receptor del ligando expresado sobre la superficie de la célula diana, e YopP, conectadas por un polipéptido que permite la translocación de la proteína quimérica o de uno de sus fragmentos, desde el endosoma al citosol de la célula, en el que el agente de dirección hacia células específicas es la parte extracelular de un receptor de TNF/NGF.

36. El método según la reivindicación 35, en el que el ligando es el TNF.

37. El método según la reivindicación 36, en el que el polipéptido que permite la translocación es el PEIItr.

38. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, en el que la célula es un macrófago o una célula monocítica.

39. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 35 a 37, en el que la proteína quimérica es la TBP-YopP. o una muteína, variante, proteína de fusión, derivado funcional, fragmento o sal de la misma.