Proteína para el diagnóstico y el seguimiento inmunológico de la hidatidosis.

La presente invención se encuadra dentro del campo de la biotecnología. Específicamente, se refiere a una nueva proteína para el diagnóstico y el seguimiento de la hidatidosis, así como a los anticuerpos que reconocen específicamente dicha proteína, al uso de la proteína o los anticuerpos para el diagnóstico de la hidatidosis, así como a un método para la obtención de datos útiles para el diagnóstico y seguimiento de la hidatidosis en un individuo que comprende el uso de la proteína o los anticuerpos, y a un kit para llevar a cabo dicho método que comprende la proteína o los anticuerpos.

Proteína para el diagnóstico V el seguimiento inmunológico de la hidatidosis La presente invención se encuentra dentro del campo de la biotecnología. Específicamente, se refiere a una proteína nueva recombinante, denominada 282t, formada mediante la clonación en tándem de un fragmento de otra, al uso de la proteína recombinante para el diagnóstico de la hidatidosis, así como a un método para la obtención de datos útiles para el diagnóstico y seguimiento de la hidatidosis en un individuo que comprende el uso de esta proteína recombinante, y a un kit que comprende dicha proteína recombinante. La presente invención también se refiere a los anticuerpos que reconocen la proteína recombinante 282t, a un método para la obtención de datos útiles para el seguimiento y diagnóstico de la hidatidosis que comprende el uso de estos anticuerpos, ya un kit que comprende dichos anticuerpos.

ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR

La hidatidosis es una enfermedad parasitaria producida fundamentalmente por los organismos Echínococcus granulosus y Echínococcus multílocularís. Echínococcus granulosus, causante de la hidatidosis unilocular, en su ciclo de vida, presenta como hospedadores finales a cánidos fundamentalmente, y como hospedadores intermediarios una gran variedad de animales, incluyendo entre otros, rumiantes domésticos o el hombre. La enfermedad se produce cuando los huevos de dichos parásitos excretados por el hospedador final, son ingeridos por el ser humano u otros animales en agua, vegetales, etc.

Estos parásitos producen quistes en pulmón, hígado, bazo, cerebro y huesos, entre otros lugares del organismo. El quiste se desarrolla durante varios años dando lugar a grandes masas, que en ocasiones, mediante diagnóstico de imagen, son confundidas con tumores u otros agentes causantes de lesiones similares. Estas masas producen presiones sobre los diversos órganos dando lugar a diversas alteraciones como por ejemplo, a hipertensión portal en el hígado llegando a provocar incluso la muerte del individuo por coma hepático.

El diagnóstico y seguimiento de la enfermedad se lleva a cabo fundamentalmente mediante métodos de imagen. No obstante, estos métodos solo sirven cuando la enfermedad se encuentra en un estado muy avanzado. Tras el diagnóstico positivo se lleva a cabo la extracción del quiste hidatídico mediante cirugía u otros, o se aplica tratamiento farmacológico. El seguimiento, tras llevar a cabo este tratamiento, se puede realizar mediante diagnóstico de imagen, pero con limitaciones, ya que pequeños quistes nuevos o viejos no se detectarán, ni tampoco ciertos cambios en quistes inducidos por tratamiento farmacológico.

Existe, por tanto, la necesidad de mejorar los métodos de diagnóstico y seguimiento de esta enfermedad por imagen, de manera que permitan realizar un diagnóstico y seguimiento temprano de la enfermedad para adecuar el tratamiento y evaluar el grado de curación.

Por otro lado, las herramientas actualmente existentes para llevar a cabo el diagnóstico y seguimiento inmunológico de la hidatidosis son poco repetitivas y no están estandarizadas. No se ha conseguido llegar a un consenso sobre el uso de una herramienta determinada para realizar dicho diagnóstico o seguimiento debido a las limitaciones que presentan las propias herramientas (Carmena et al, 2006. Acta Trop. 98:74-86) .

El mayor problema al que se enfrentan los diversos antígenos para ser aptos para el inmunodiagnóstico es la validación de la utilidad de los mismos en un número apreciable de pacientes. Además dichos antígenos, para permitir su uso y la repetitividad de los resultados, han de encontrarse bien caracterizados.

Se han postulado diversas herramientas para el serodiagnóstico de la hidatidosis, incluyendo antígenos naturales, antígenos recombinantes e incluso péptidos sintéticos. Sin embargo, a pesar de estas aproximaciones, debido a la falta de efectividad de los antígenos, éstos caen en desuso y no son aplicados de forma habitual y determinante para el diagnóstico. Este es el caso, por ejemplo, del antígeno recombinante 82 (Fernández et al, 1996. Mol Biochem Parasitol. 77:247-250) . Este antígeno presenta resultados variables entre diversos autores, lo que implica que los experimentos llevados a cabo con esta herramienta presentan una baja repetitividad, y por ello una baja aplicabilidad en el diagnóstico. De este antígeno se han creado diversos derivados que también presentan resultados poco repetitivos (UY26430; Gonzalez-Sapienza et al, 2000. J Clín Microbiol. 38:3979-3983) .

En la actualidad existen pocos kits comerciales para el diagnóstico de la hidatidosis, la mayor parte de ellos basados en antígenos nativos, los cuales están poco caracterizados. Esto hace que no exista un consenso en cuanto al uso concreto de uno de ellos. En la actualidad no existe ningún kit comercial para el seguimiento de la hidatidosis, definido como tal.

Existe por tanto la necesidad de encontrar nuevas herramientas inmunológicas que permitan el diagnóstico y seguimiento de la hidatidosis de forma reproducible y fiable. Esta herramientas inmunológicas han de encontrarse bien caracterizadas y definidas para permitir la estandarización de sus resultados y su aplicabilidad de forma rutinaria.

DESCRIPCiÓN DE LA INVENCiÓN

La presente invención se refiere a una proteína recombinante, denominada proteína 282t, formada mediante la clonación en tándem de un fragmento de otra, y al uso de dicha proteína para el diagnóstico y seguimiento de la hidatidosis, así como a un método para la obtención de datos útiles para el diagnóstico o seguimiento de hidatidosis y a un kit que comprende los elementos necesarios para llevar a cabo dicho método. La presente invención también se refiere a los anticuerpos que reconocen la proteína recombinante 282t, así como a un método para la obtención de datos útiles para el diagnostico o seguimiento de la hidatidosis basado en dichos anticuerpos, ya un kit que comprende los elementos necesarios para la realización de dicho método.

En la presente invención se demuestra cómo la proteína 282t mejora tanto la sensibilidad como la especificidad diagnóstica frente a la proteína 82t descrita previamente. Además, dicha proteína 282t presenta también un mayor rendimiento diagnóstico frente a kits comerciales previamente desarrollados. También se demuestra que la clonación en concreto de dos copias de un fragmento de la proteína recombinante 82, presenta una mayor utilidad diagnóstica que la clonación de mayor número de copias. La proteína 282t consiste en la clonación en tándem en número de dos copias de la proteína recombinante 82 truncada en su extremo N-terminal (82t) , y su secuencia es SEO ID NO: 1.

De igual forma que ocurre con muchas de las proteínas descritas, como por ejemplo entre proteínas homólogas en diferentes organismos, muchas proteínas presentan alteraciones en sus secuencias de aminoácidos, las cuales no varían ni la funcionalidad de las proteínas, ni su estructura de forma sustancial, considerándose variaciones inocuas. Estas alteraciones, por tanto, no serían determinantes en el polipéptido ni para su estructura ni para su actividad.

Los polipéptidos pueden presentar variantes. Estas variantes se refieren a variaciones limitadas en la secuencia aminoacídica, que permiten el mantenimiento de la funcionalidad del péptido. Esto quiere decir que la secuencia de referencia y la secuencia de la variante son similares en conjunto, e idénticas en muchas regiones. Estas variaciones se generan por sustituciones, deleciones o adiciones. Dichas sustitu ci o n es so n po r aminoácidos conservados. Los aminoácidos conservados son aminoácidos que tienen cadenas laterales y propiedades similares en cuanto a, por ejemplo, hidrofobicidad o aromaticidad. Estas sustituciones incluyen, aunque sin limitarse, sustituciones entre ácido glutámico (Glu) y ácido aspártico (Asp) , entre Lisina (Lys) y Arginina (Arg) , entre asparagina (Asn) y glutamina (Gln) , entre serina (Ser) y treonina (Thr) , y/o entre los aminoácidos que componen el grupo alanina (Ala) , leucina (Leu) , valina (Val) e isoleucina (1Ie) . Las variaciones pueden ser variaciones generadas artificialmente como por ejemplo mediante mutagénesis o síntesis directa. Estas variaciones no provocan modificaciones esenciales en las características o propiedades esenciales del polipéptido.

Por todo ello un primer aspecto de la invención se refiere a un polipéptido aislado, o "polipéptido de la invención", que comprende una secuencia de aminoácidos... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido aislado que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95% de identidad con respecto a la secuencia SEO ID NO: 1, sobre la longitud completa de la SEO ID NO: 1.

2. Un polipéptido aislado según la reivindicación 1 donde la identidad con respecto a la secuencia SEO ID NO: 1 sobre la longitud completa de la SEO ID NO: 1, es de al menos el 99%.

3. Un polipéptido aislado según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEO ID NO: 1.

4. Un polinucleótido aislado que codifica para el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o una secuencia nucleotídica complementaria a dicho polinucleótido aislado.

5. Un polinucleótido aislado según la reivindicación 4 que comprende la secuencia nucleotídica SEO ID NO: 2.

6. Un anticuerpo que se une específicamente a un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

7. Uso de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o de un anticuerpo según la reivindicación 6 para el diagnóstico in vitro de hidatidosis.

8. Uso de un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 o de un anticuerpo según la reivindicación 6 para el seguimiento de hidatidosis.

9. Uso de un péptido o un anticuerpo según las reivindicaciones 7 u 8 donde la hidatidosis es hidatidosis unilocular.

10. Método para la obtención de datos útiles para el diagnóstico o el seguimiento de hidatidosis que comprende:

a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, b) poner en contacto un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 con la muestra biológica aislada del paso (a) , y c) detectar la formación de complejos polipéptido/anticuerpo en la muestra del paso (b) .

11. Método según la reivindicación 10 que además comprende:

d) asociar al individuo del paso (a) al grupo de pacientes con hidatidosis en caso de detectar la formación de complejos en el paso (c)

12. Método cualquiera de las reivindicaciones 10 u 11 donde el individuo del paso (a) ha sido previamente diagnosticado de hidatidosis.

13. Método de obtención de datos útiles para el diagnóstico o el seguimiento de

hidatidosis que comprende:

a) obtener una muestra biológica aislada de un individuo, b) poner en contacto un anticuerpo según la reivindicación 6 con la muestra biológica aislada del paso (a) , y c) detectar la formación de complejos polipéptido/anticuerpo en la muestra del paso (b) .

14. Método según la reivindicación 13 que comprende:

d) asociar al individuo del paso (a) al grupo de pacientes con hidatidosis en caso de detectar la formación de complejos en el paso (c) .

15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 14 donde el individuo del paso (a) ha sido previamente diagnosticado de hidatidosis.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15 donde la hidatidosis es hidatidosis unilocular.

17. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16 donde la muestra biológica aislada del paso (a) es suero, plasma, sangre, líquido hidatídico, material extraído de una lesión hidatídica, o líquido cefaloraquídeo.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 17 donde la muestra biológica aislada procede de un mamífero.

19. Método según la reivindicación 18 donde el mamífero es un rumiante o un 10 humano.

20. Kit para llevar a cabo un método según cualquiera de las reivindicaciones 10 a 12, que comprende un péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

21. Kit para llevar a cabo un método según cualquiera de las reivindicaciones 13 a 15, que comprende un anticuerpo según la reivindicación 6.

22. Uso del kit según cualquiera de las reivindicaciones 20 ó 21 para el diagnóstico o seguimiento de la hidatidosis.

23. Uso del kit según la reivindicación 22 donde la hidatidosis es hidatidosis unilocular LISTADO DE SECUENCIAS

<110> consejo superior de Investigaciones científicas (CSIC)

<120> Proteína para el diagnóstico y el seguimiento inmunológico de la hidatidosis <130> Es1641.708

<160> 8

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 169

<212> PRT

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Proteína 2B2t

<400> 1

Gly Ser Pro Glu Phe ASp Tyr Arg Ser Lys ASp Glu Pro Lys Ala Hi s 1 5 10 15

Met Gly Gln val val Lys Lys Arg Trp Gly Glu Leu Arg ASp Phe Phe 20 25 30

Arg Asn ASp Pro Leu Gly Gln Arg Leu val Ala Leu Gly Asn ASp Leu 35 40 45

Thr Ala Ile cys Gln Lys Leu Gln Leu Lys Ile Arg Glu Val Leu Lys 50 55 60

Lys Tyr val Lys Asn Leu val Glu Glu Lys ASp ASp ASp Ser Lys Gly 65 70 75 80

Ser Lys ASp Glu Pro Lys Ala Hi s Met Gly Gln Val val Lys Lys Arg 85 90 95

Trp Gly Glu Leu Arg ASp Phe Phe Arg Asn ASp Pro Leu Gly Gln Arg 100 105 110

Leu val Ala Leu Gly Asn ASp Leu Thr Ala Ile cys Gln Lys Leu Gln 115 120 125

Leu Lys Ile Arg Gl u val Leu Lys Lys Tyr val Lys Asn Leu val Glu 130 135 140

Glu Lys ASp ASp ASp Ser Lys Gly Ser Ile Ile Thr Ser Glu Phe Pro 145 150 155 160

Gly Arg Leu Glu Arg Pro His Arg ASp165

<210> 2

<211> 507

<212> DNA

<213> Secuencia Arti fi ci al <220>

<223> Polinucleótido 2B2t

<400> 2 ggatccccgg aattcgatta cagatctaaa gatgagccaa aagcacacat

gtaaaaaaaa gatggggtga acttcgagac ttctttagaa atgatccact

cttgtcgctc ttggcaatga cctaactgcc atttgccaga agctgcaatt

gaggtgctga agaagtatgt taagaatttg gtggaagaaa aagatgatga tctaaagatg agccaaaagc acacatgggg caagtggtaa aaaaaagatg

cgagacttct ttagaaatga tccactgggt caaagacttg tcgctcttgg

actgccattt gccagaagct gcaattgaag attcgtgagg tgctgaagaa aatttggtgg aagaaaaaga tgatgattca aagggatcca taatcactag

ggtcgactcg agcggccgca tcgtgac

<210> 3

<211> 74

<212> PRT

<213> Secuencia Arti fi ci al <220>

<223> Proteína B2t

<400> 3

Gly rle Pro Pro Lys ASp Glu Pro Lys Ala Hi s Met Gly Gln 1 5 10

Lys Lys Arg Trp Gly Glu Leu Arg ASp Phe Phe Arg Asn ASp 20 25 30

Gly Gln Arg Leu val Ala Leu Gly Asn ASp Leu Thr Ala rle 35 40 45

Lys Leu Gln Leu Lys rle Arg Glu val Leu Lys Lys Tyr val 50 55 60

Leu val Glu Glu Lys ASp ASp ASp Ser Lys 65 70

<210> 4

<211> 25

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador con secuencia de restricción Bglrr <400> 4 acagatctaa agatgagcca aaagc

<210> 5

ggggcaagtg gggtcaaaga gaagattcgt ttcaaaggga gggtgaactt caatgaccta gtatgttaag tgaattcccg

Val val Pro Leu cys Gln Lys Asn 60 120 180 240 300 360 420 480 507

<211> 23

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Cebador con secuencia de restricción BamHr <400> 5 atggatccct ttgaatcatc atc

<210> 6

<211> 226

<212> DNA

<213> Secuencia Artificial <220>

<223> Producto intermedio de PCR

<400> 6 acagatctaa agatgagcca aaagcacaca tggggcaagt ggtaaaaaaa agatggggtg

aacttcgaga cttctttaga aatgatccac tgggtcaaag acttgtcgct cttggcaatg

acctaactgc catttgccag aagctgcaat tgaagattcg tgaggtgctg aagaagtatg

ttaagaattt ggtggaagaa aaagatgatg attcaaaggg atccat

<210> 7

<211> 313

<212> PRT

<213> Secuencia Arti fi ci al <220>

<223> Proteína 4B2t

<400> 7

Gly Ser Pro Glu Phe ASp Tyr Arg Ser Lys ASp Glu Pro Lys Ala Hi s 1 5 10 15

Met Gly Gln val val Lys Lys Arg Trp Gly Glu Leu Arg ASp Phe Phe 20 25 30

Arg Asn ASp Pro Leu Gly Gln Arg Leu val Ala Leu Gly Asn ASp Leu 35 40 45

Thr Ala rle cys Gln Lys Leu Gln Leu Lys rle Arg Glu Val Leu Lys 50 55 60

Lys Tyr val Lys Asn Leu val Glu Glu Lys ASp ASp ASp Ser Lys Gly 65 70 75 80

Ser Lys ASp Glu Pro Lys Ala His Met Gly Gln Val val Lys Lys Arg 85 90 95

Trp Gly Glu Leu Arg ASp Phe Phe Arg Asn ASp Pro Leu Gly Gln Arg 100 105 110

Leu val Ala Leu Gly Asn ASp Leu Thr Ala rle cys Gln Lys Leu Gln 115 120 125

60 120 180 226

Leu Lys rle Arg Glu val Leu Lys Lys Tyr val Lys Asn Leu val Glu 130 135 140

Glu Lys ASp ASp ASp Ser Lys Gly Ser Lys ASp Glu Pro Lys Ala Hi s 145 150 155 160

Met Gly Gln val val Lys Lys Arg Trp Gly Glu Leu Arg ASp Phe Phe 165 170 175

Arg Asn ASp Pro Leu Gly Gln Arg Leu val Ala Leu Gly Asn ASp Leu 180 185 190

Thr Ala rle cys Gln Lys Leu Gln Leu Lys rle Arg Glu Val Leu Lys 195 200 205

Lys Tyr val Lys Asn Leu val Glu Glu Lys ASp ASp ASp Ser Lys Gly 210 215 220

Ser Lys ASp Glu Pro Lys Ala His Met Gly Gln Val val Lys Lys Arg 225 230 235 240

Trp Gly Glu Leu Arg ASp Phe Phe Arg Asn ASp Pro Leu Gly Gln Arg 245 250 255

Leu val Ala Leu Gly Asn ASp Leu Thr Ala rle cys Gln Lys Leu Gln 260 265 270

Leu Lys rle Arg Glu val Leu Lys Lys Tyr val Lys Asn Leu val Glu 275 280 285

Glu Lys ASp ASp ASp Ser Lys Gly Ser rle rle Thr Ser Glu Phe Pro 290 295 300

Gly Arg Leu Glu Arg Pro His Arg ASp 305 310

<210> 8

<211> 601

<212> PRT

<213> Secuencia Arti fi ci al <220>

<223> Proteína 8B2t

<400> 8

Gly Ser Pro Glu Phe ASp Tyr Arg Ser Lys ASp Glu Pro Lys Ala His 1 5 10 15

Met Gly Gln val val Lys Lys Arg Trp Gly Glu Leu Arg ASp Phe Phe 20 25 30

Arg Asn ASp Pro Leu Gly Gln Arg Leu val Ala Leu Gly Asn ASp Leu 40 45

Thr Ala rle cys Gln Lys Leu Gln Leu Lys rle Arg Glu Val Leu Lys 50 55 60

Lys Tyr val Lys Asn Leu val Glu Glu Lys ASp ASp ASp Ser Lys Gly 65 70 75 80

Ser Lys ASp Glu Pro Lys Ala Hi s Met Gly Gln Val val Lys Lys Arg 85 90 95

Trp Gly Glu Leu Arg ASp Phe Phe Arg Asn ASp Pro Leu Gly Gln Arg 100 105 110

Leu val Ala Leu Gly Asn ASp Leu Thr Ala rle cys Gln Lys Leu Gln 115 120 125

Leu Lys rle Arg Gl u val Leu Lys Lys Tyr val Lys Asn Leu val Glu 130 135 140

Glu Lys ASp ASp ASp Ser Lys Gly Ser Lys ASp Glu Pro Lys Ala Hi s 145 150 155 160

Met Gly Gln val val Lys Lys Arg Trp Gly Glu Leu Arg ASp Phe Phe 165 170 175

Arg Asn ASp Pro Leu Gly Gln Arg Leu val Ala Leu Gly Asn ASp Leu 180 185 190

Thr Ala rle cys Gln Lys Leu Gln Leu Lys rle Arg Glu Val Leu Lys 195 200 205

Lys Tyr val Lys Asn Leu val Glu Glu Lys ASp ASp ASp Ser Lys Gly 210 215 220

Ser Lys ASp Glu Pro Lys Ala His Met Gly Gln Val val Lys Lys Arg 225 230 235 240

Trp Gly Glu Leu Arg ASp Phe Phe Arg Asn ASp Pro Leu Gly Gln Arg 245 250 255

Leu val Ala Leu Gly Asn ASp Leu Thr Ala rle cys Gln Lys Leu Gln 260 265 270

Leu Lys rle Arg Glu val Leu Lys Lys Tyr val Lys Asn Leu val Glu 275 280 285

Glu Lys ASp ASp ASp Ser Lys Gly Ser Lys ASp Glu Pro Lys Ala His 290 295 300

Met Gly Gln val val Lys Lys Arg Trp Gly Glu Leu Arg ASp Phe Phe 305 310 315 320

Arg Asn ASp Pro Leu Gly Gln Arg Leu val Ala Leu Gly Asn ASp Leu 325 330 335

Thr Ala rle cys Gln Lys Leu Gln Leu Lys rle Arg Glu Val Leu Lys 340 345 350

Lys Tyr val Lys Asn Leu val Glu Glu Lys ASp ASp ASp Ser Lys Gly 355 360 365

Ser Lys ASp Glu Pro Lys Ala His Met Gly Gln Val val Lys Lys Arg 370 375 380

Trp Gly Glu Leu Arg ASp Phe Phe Arg Asn ASp Pro Leu Gly Gln Arg 385 390 395 400

Leu val Ala Leu Gly Asn ASp Leu Thr Ala rle cys Gln Lys Leu Gln 405 410 415

Leu Lys rle Arg Glu val Leu Lys Lys Tyr val Lys Asn Leu val Glu 420 425 430

Glu Lys ASp ASp ASp Ser Lys Gly Ser Lys ASp Glu Pro Lys Ala His 435 440 445

Met Gly Gln val val Lys Lys Arg Trp Gly Glu Leu Arg ASp Phe Phe 450 455 460

Arg Asn ASp Pro Leu Gly Gln Arg Leu val Ala Leu Gly Asn ASp Leu 465 470 475 480

Thr Ala rle cys Gln Lys Leu Gln Leu Lys rle Arg Glu Val Leu Lys 485 490 495

Lys Tyr val Lys Asn Leu val Glu Glu Lys ASp ASp ASp Ser Lys Gly 500 505 510

Ser Lys ASp Glu Pro Lys Ala Hi s Met Gly Gln Val val Lys Lys Arg 515 520 525

Trp Gly Glu Leu Arg ASp Phe Phe Arg Asn ASp Pro Leu Gly Gln Arg 530 535 540

Leu val Ala Leu Gly Asn ASp Leu Thr Ala rle cys Gln Lys Leu Gln 545 550 555 560

Leu Lys rle Arg Glu val Leu Lys Lys Tyr val Lys Asn Leu val Glu 565 570 575

Glu Lys ASp ASp ASp Ser Lys Gly Ser rle rle Thr Ser Glu Phe Pro 580 585 590

Gly Arg Leu Glu Arg Pro His Arg ASp 595 600